| 查看: 1841 | 回复: 4 | ||
dhmdddd木虫 (正式写手)
|
[求助]
请教关于宝公司pMD18T连接问题
|
用pMD18T连接PCR产物，老是连不上，最开始只知道利用的是polyA和载体上的T连接起来，今天看了看T载的说明书感到有点小疑惑，连接做了几次，单跑质粒的后就是话感觉大小是对的，但是酶切后面再看就不对了，这是不是压根就没有连上？还是什么情况？求解释……补充一下，我的目的基因两边的酶切位点是EcoR I 和BamH I  [ Last edited by dhmdddd on 2011-4-26 at 15:51 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
081700，311，求调剂
已经有15人回复
-
一志愿北京化工085600 310分求调剂
已经有18人回复
-
085600材料与化工301分求调剂院校
已经有4人回复
-
材料与化工371求调剂
已经有14人回复
-
336材料与化工085600求调剂
已经有7人回复
-
材料334求调剂
已经有18人回复
-
331求调剂
已经有8人回复
-
332求调剂
已经有17人回复
-
一志愿南京航空航天大学 材料与化工329分求调剂
已经有4人回复
-
材料专硕322
已经有7人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请教关于SCI投稿的一些问题
已经有5人回复
- 请教一下连接与转化问题！
已经有11人回复
- 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
已经有26人回复
- 请教一下载体连接的问题
已经有5人回复
- 关于PCR产物与pMD 19Tsimple连接的问题
已经有19人回复
- 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题
已经有15人回复
- 【求助/交流】pMD-18T载体连接出现了问题，请各位高手指点！！！
已经有17人回复
- 【求助/交流】请教连接转化方面的问题
已经有14人回复
- 【求助】请教：气相，连接问题？？
已经有7人回复
- 【求助/交流】以连接产物做模板扩增此连接产物，有问题请教各位达人~麻烦您帮忙分析下
已经有9人回复
susizheng
木虫 (著名写手)
我們是糖 甜到憂傷
- BioEPI: 8
- 应助: 130 (高中生)
- 贵宾: 0.008
- 金币: 4738.3
- 散金: 2273
- 红花: 56
- 帖子: 2308
- 在线: 740.7小时
- 虫号: 642666
- 注册: 2008-11-01
- 性别: GG
- 专业: 有机合成
2楼2011-04-26 16:37:43
liu_juan82
金虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 489.1
- 帖子: 41
- 在线: 24.8小时
- 虫号: 615810
- 注册: 2008-10-03
- 性别: MM
- 专业: 生物技术药物
【答案】应助回帖
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 很积极，很热心~~ 2011-04-26 22:55:14
dhmdddd(金币+3): 十分感谢，那就应该是没有连上，后面酶切验证的时候没有我目的基因大小的片段！ 2011-04-27 13:23:22
lstt09nk(金币+3): 很积极，很热心~~ 2011-04-26 22:55:14
dhmdddd(金币+3): 十分感谢，那就应该是没有连上，后面酶切验证的时候没有我目的基因大小的片段！ 2011-04-27 13:23:22
|
首先，如楼上所说，T载体连接依据的是taq酶能够在扩增片段的末端加A，而载体的末端被认为加上T，两者配对连接的。如果你的酶不能在片段末端加A，肯定不能和载体连接。 再次，质粒一般是环形的，提取的质粒，线性的几乎很少。而你在电泳的时候，所用的评判质粒大小的是线性的DNA marker，所以用电泳的方式验证质粒是否连接上是不可靠的。判断质粒是否是阳性的一般用PCR结合双酶切进行验证。 第三，质粒连接的效率还取决于连接体系中载体和插入片段的摩尔比例。T载体推荐的是载体：DNA=1：2~1:10,我平时一般用1：5左右，基本不会出现连接不上的问题。 希望上述解释能帮助你。 |
3楼2011-04-26 21:21:16
zgb1982
木虫 (正式写手)
- 应助: 46 (小学生)
- 金币: 2895.3
- 红花: 3
- 帖子: 536
- 在线: 227.2小时
- 虫号: 664342
- 注册: 2008-11-29
- 专业: 植物病理学
4楼2011-04-27 10:26:03
charles08
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 5793.3
- 散金: 2103
- 红花: 27
- 帖子: 1929
- 在线: 603.2小时
- 虫号: 823046
- 注册: 2009-08-06
- 性别: GG
- 专业: 植物病理学
5楼2013-11-06 09:13:29
5