24小时热门版块排行榜

返回列表

dhmdddd

木虫 (正式写手)

应助: 10 (幼儿园)
贵宾: 0.01
金币: 3929.1
散金: 939
红花: 3
帖子: 815
在线: 561小时
虫号: 839789
注册: 2009-09-03
性别: MM
专业: 微生物遗传育种学

[求助] 请教关于宝公司pMD18T连接问题

用pMD18T连接PCR产物，老是连不上，最开始只知道利用的是polyA和载体上的T连接起来，今天看了看T载的说明书感到有点小疑惑，连接做了几次，单跑质粒的后就是话感觉大小是对的，但是酶切后面再看就不对了，这是不是压根就没有连上？还是什么情况？求解释……补充一下，我的目的基因两边的酶切位点是EcoR I 和BamH I

[ Last edited by dhmdddd on 2011-4-26 at 15:51 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

求个博导看看已经有17人回复
青基代表作，AAAI之类的A会的special track在国内认可度高吗？还是归为workshop之流？已经有3人回复
上海工程技术大学【激光智能制造】课题组招收硕士已经有6人回复
带资进组求博导收留已经有11人回复
自荐读博已经有5人回复
上海工程技术大学张培磊教授团队招收博士生已经有4人回复
求助院士们，这个如何合成呀已经有4人回复
临港实验室与上科大联培博士招生1名已经有9人回复
写了一篇“相变储能技术在冷库中应用”的论文，论文内容以实验为主，投什么期刊合适？已经有6人回复
最近几年招的学生写论文不引自己组发的文章已经有11人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

请教关于SCI投稿的一些问题已经有5人回复
请教一下连接与转化问题！已经有11人回复
高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上已经有26人回复
请教一下载体连接的问题已经有5人回复
关于PCR产物与pMD 19Tsimple连接的问题已经有19人回复
【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？已经有20人回复
【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题已经有15人回复
【求助/交流】pMD-18T载体连接出现了问题，请各位高手指点！！！已经有17人回复
【求助/交流】请教连接转化方面的问题已经有14人回复
【求助】请教：气相，连接问题？？已经有7人回复
【求助/交流】以连接产物做模板扩增此连接产物，有问题请教各位达人~麻烦您帮忙分析下已经有9人回复

上班族，学习ing……

1楼 2011-04-26 15:16:39

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖甜到憂傷

BioEPI: 8
应助: 130 (高中生)
贵宾: 0.008
金币: 4738.3
散金: 2273
红花: 56
帖子: 2308
在线: 740.7小时
虫号: 642666
注册: 2008-11-01
性别: GG
专业: 有机合成

【答案】应助回帖

dhmdddd(金币+1): 我用的加酶有加A，但是后面连的时候总是问题…… 2011-04-26 18:38:14

不是ployA，是DNA聚合酶扩增时能在PCR产物5‘端加上一个A。
因此做TA克隆，先看看你用的酶有没有加A功能。

赞一下

回复此楼

Thank-you，so-blue.

2楼2011-04-26 16:37:43

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

liu_juan82

金虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 489.1
帖子: 41
在线: 24.8小时
虫号: 615810
注册: 2008-10-03
性别: MM
专业: 生物技术药物

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 很积极，很热心~~ 2011-04-26 22:55:14
dhmdddd(金币+3): 十分感谢，那就应该是没有连上，后面酶切验证的时候没有我目的基因大小的片段！ 2011-04-27 13:23:22

引用回帖:

Originally posted by dhmdddd at 2011-04-26 15:16:39:
用pMD18T连接PCR产物，老是连不上，最开始只知道利用的是polyA和载体上的T连接起来，今天看了看T载的说明书感到有点小疑惑，连接做了几次，单跑质粒的后就是话感觉大小是对的，但是酶切后面再看就不对了，这是不是 ...

首先，如楼上所说，T载体连接依据的是taq酶能够在扩增片段的末端加A，而载体的末端被认为加上T，两者配对连接的。如果你的酶不能在片段末端加A，肯定不能和载体连接。
再次，质粒一般是环形的，提取的质粒，线性的几乎很少。而你在电泳的时候，所用的评判质粒大小的是线性的DNA marker，所以用电泳的方式验证质粒是否连接上是不可靠的。判断质粒是否是阳性的一般用PCR结合双酶切进行验证。
第三，质粒连接的效率还取决于连接体系中载体和插入片段的摩尔比例。T载体推荐的是载体：DNA=1：2~1:10,我平时一般用1：5左右，基本不会出现连接不上的问题。
希望上述解释能帮助你。

赞一下(2人)

回复此楼

3楼2011-04-26 21:21:16

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖