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kakaqa

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题

我克隆基因扩增得到了一个3000bp的片段，现在问题来了，我们实验室只有pMD18-T这种载体，听说这种载体连接3000bp的片段有点难度，但也能连上，请教用这种载体连过3000bp条带的高手，连接体系是怎样的，多少度需要连接多久，我已经做了3次了，结果都是失败，相当的郁闷啊！！！
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1楼 2010-11-11 18:59:10
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jackiechubut

木虫 (小有名气)
2200左右的倒是连过，不过没用这个T载体，实在连不上你可以考虑购买其他的T载体连接下。
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2楼2010-11-11 21:10:53
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
★
amisking(金币+1):鼓励交流！ 2010-11-11 21:45:09
3kb有点大，你是用普通TAQ做的吗？最好用高保真酶把产物纯化后再加普通TAQ跟dNTPs 72度半小时，再连pMD18-T 16度反应五六个小时。我实验室有这么做的结果不错。希望你成功。
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3楼2010-11-11 21:16:30
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kakaqa

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lvbobo823 at 2010-11-11 21:16:30:
3kb有点大，你是用普通TAQ做的吗？最好用高保真酶把产物纯化后再加普通TAQ跟dNTPs 72度半小时，再连pMD18-T 16度反应五六个小时。我实验室有这么做的结果不错。希望你成功。

我是用TAKARA的EXtaq做的，连了好多次都连不上，回收的条带很亮，但就是连接不上，真是郁闷死了，我是连接过夜的，现在又做了一次，希望能成功。哎，没办法，就碰运气了，载体本身只有2.7kb，希望这次运气不错。
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4楼2010-11-12 08:18:07
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-12 20:25:52
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。
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5楼2010-11-12 20:06:36
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kakaqa

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yzuxhq368 at 2010-11-12 20:06:36:
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。

请问你是16度连的吗。还有载体和插入片段各加了多少微升，谢谢。
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6楼2010-11-13 21:17:13
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
有段时间了，反正是按说明书上的用量和温度，时间记不得了，可能有7-8小时。不过片段浓度和纯度都是用nanodrop测过的，挺好的。260/280在1.8-1.9之间，浓度大概在200左右。
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7楼2010-11-13 21:53:17
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
我用的是takara的pMD18T-Simple，载体存放时间也挺长的，用剩的一点点，好像载体用了一微升，solution 1用了5微升，片段加了4微升?
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8楼2010-11-13 21:59:15
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zgb1982

木虫 (正式写手)
单纯从连接上讲，不算难连吧，我连过4.3Kb的，4度过夜，10ul体系，测序了，不过存在突变位点。
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9楼2010-11-13 22:06:53
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
用的solutin1还是T4连接酶啊？条件要最佳
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10楼2010-11-13 22:10:24
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glannee

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-13 23:51:49
kakaqa(金币+5):恩，好的，我再试试。 2010-11-14 12:33:25
我最大连过6.5k的片段，2次操作就连上了，没有问题。用的是takara的pMD18T-Simple，10微升体系，16℃10小时（或者过夜）。片段浓度大概是100-150ng，基本就按说明书的量操作，
载体用了1微升，
solution 1用了5微升，
片段加了4微升
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11楼2010-11-13 22:53:25
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by kakaqa at 2010-11-12 08:18:07:



我是用TAKARA的EXtaq做的，连了好多次都连不上，回收的条带很亮，但就是连接不上，真是郁闷死了，我是连接过夜的，现在又做了一次，希望能成功。哎，没办法，就碰运气了，载体本身只有2.7kb，希望这次运气不 ...

放4度过夜试试，我们这有这么连上的，用的载体和酶与你的一样
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12楼2010-11-14 18:08:13
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-11-14 18:08:13:

放4度过夜试试，我们这有这么连上的，用的载体和酶与你的一样

还有，你加连接产物和载体的时候，最好先定个量，然后按说明书中的比例加
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13楼2010-11-14 18:09:17
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898763077

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2585526&fpage=1
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14楼2010-11-14 18:20:13
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
T载体不用T4连接的。TAKARA的T载体酶和buffer都是自带的
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15楼2010-11-14 19:27:18
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pushizi

木虫 (小有名气)
这个跟你的基因也有关系的，要是二级结构复杂就难办了
我们实验室一直都用1:3-1:5（摩尔比），4000 bp多的都有连上的，但是有时3kb的也有连不上，送测序都测得费劲，只要你没遇上那种基因，一般连个2小时，转化时感受态效率高点就没事，祝你成功
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16楼2010-11-14 22:43:12
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