应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题
161/1返回列表
查看: 2928  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

kakaqa

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题

我克隆基因扩增得到了一个3000bp的片段，现在问题来了，我们实验室只有pMD18-T这种载体，听说这种载体连接3000bp的片段有点难度，但也能连上，请教用这种载体连过3000bp条带的高手，连接体系是怎样的，多少度需要连接多久，我已经做了3次了，结果都是失败，相当的郁闷啊！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2010-11-11 18:59:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jackiechubut

木虫 (小有名气)
2200左右的倒是连过，不过没用这个T载体，实在连不上你可以考虑购买其他的T载体连接下。
赞一下 回复此楼
2楼2010-11-11 21:10:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
★
amisking(金币+1):鼓励交流！ 2010-11-11 21:45:09
3kb有点大，你是用普通TAQ做的吗？最好用高保真酶把产物纯化后再加普通TAQ跟dNTPs 72度半小时，再连pMD18-T 16度反应五六个小时。我实验室有这么做的结果不错。希望你成功。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-11-11 21:16:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kakaqa

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lvbobo823 at 2010-11-11 21:16:30:
3kb有点大，你是用普通TAQ做的吗？最好用高保真酶把产物纯化后再加普通TAQ跟dNTPs 72度半小时，再连pMD18-T 16度反应五六个小时。我实验室有这么做的结果不错。希望你成功。

我是用TAKARA的EXtaq做的，连了好多次都连不上，回收的条带很亮，但就是连接不上，真是郁闷死了，我是连接过夜的，现在又做了一次，希望能成功。哎，没办法，就碰运气了，载体本身只有2.7kb，希望这次运气不错。
赞一下 回复此楼
4楼2010-11-12 08:18:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-12 20:25:52
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2010-11-12 20:06:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kakaqa

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yzuxhq368 at 2010-11-12 20:06:36:
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。

请问你是16度连的吗。还有载体和插入片段各加了多少微升，谢谢。
赞一下 回复此楼
6楼2010-11-13 21:17:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yzuxhq368

金虫 (小有名气)
有段时间了，反正是按说明书上的用量和温度，时间记不得了，可能有7-8小时。不过片段浓度和纯度都是用nanodrop测过的，挺好的。260/280在1.8-1.9之间，浓度大概在200左右。
赞一下 回复此楼
7楼2010-11-13 21:53:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yzuxhq368

金虫 (小有名气)
我用的是takara的pMD18T-Simple，载体存放时间也挺长的，用剩的一点点，好像载体用了一微升，solution 1用了5微升，片段加了4微升?
赞一下 回复此楼
8楼2010-11-13 21:59:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zgb1982

木虫 (正式写手)
单纯从连接上讲，不算难连吧，我连过4.3Kb的，4度过夜，10ul体系，测序了，不过存在突变位点。
赞一下 回复此楼
9楼2010-11-13 22:06:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxn2010

木虫 (著名写手)
用的solutin1还是T4连接酶啊？条件要最佳
赞一下 回复此楼
10楼2010-11-13 22:10:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

glannee

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-13 23:51:49
kakaqa(金币+5):恩，好的，我再试试。 2010-11-14 12:33:25
我最大连过6.5k的片段，2次操作就连上了，没有问题。用的是takara的pMD18T-Simple，10微升体系，16℃10小时（或者过夜）。片段浓度大概是100-150ng，基本就按说明书的量操作，
载体用了1微升，
solution 1用了5微升，
片段加了4微升
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2010-11-13 22:53:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by kakaqa at 2010-11-12 08:18:07:



我是用TAKARA的EXtaq做的，连了好多次都连不上，回收的条带很亮，但就是连接不上，真是郁闷死了，我是连接过夜的，现在又做了一次，希望能成功。哎，没办法，就碰运气了，载体本身只有2.7kb，希望这次运气不 ...

放4度过夜试试，我们这有这么连上的，用的载体和酶与你的一样
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2010-11-14 18:08:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-11-14 18:08:13:

放4度过夜试试，我们这有这么连上的，用的载体和酶与你的一样

还有，你加连接产物和载体的时候，最好先定个量，然后按说明书中的比例加
赞一下 回复此楼
13楼2010-11-14 18:09:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

898763077

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2585526&fpage=1
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2010-11-14 18:20:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
T载体不用T4连接的。TAKARA的T载体酶和buffer都是自带的
赞一下(1人) 回复此楼
15楼2010-11-14 19:27:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pushizi

木虫 (小有名气)
这个跟你的基因也有关系的，要是二级结构复杂就难办了
我们实验室一直都用1:3-1:5（摩尔比），4000 bp多的都有连上的，但是有时3kb的也有连不上，送测序都测得费劲，只要你没遇上那种基因，一般连个2小时，转化时感受态效率高点就没事，祝你成功
赞一下 回复此楼
16楼2010-11-14 22:43:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 kakaqa 的主题更新
161/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 情人节自我反思：在爱情中有过遗憾吗？ +5 瞬息宇宙 2026-02-15 6/300 2026-02-18 12:51 by 月下雪林
[找工作] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 i3cz6qj6l2 2026-02-17 3/150 2026-02-18 11:09 by lqtl9djx19
[考博] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 i3cz6qj6l2 2026-02-17 3/150 2026-02-18 10:54 by lqtl9djx19
[考研] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 i3cz6qj6l2 2026-02-17 3/150 2026-02-18 10:39 by lqtl9djx19
[考研] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 3/150 2026-02-18 08:53 by lqtl9djx19
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 3/150 2026-02-18 08:38 by lqtl9djx19
[找工作] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +4 pnpwoqbg8f 2026-02-17 4/200 2026-02-18 07:55 by lotyj5cz79
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-16 4/200 2026-02-18 07:40 by lotyj5cz79
[考研] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +4 pnpwoqbg8f 2026-02-16 4/200 2026-02-18 07:38 by lotyj5cz79
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +4 pnpwoqbg8f 2026-02-16 4/200 2026-02-18 07:23 by lotyj5cz79
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +4 pnpwoqbg8f 2026-02-16 4/200 2026-02-18 07:08 by lotyj5cz79
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-16 3/150 2026-02-18 06:53 by lotyj5cz79
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 3/150 2026-02-18 00:40 by tk2gfblvuz
[找工作] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 4/200 2026-02-18 00:23 by tk2gfblvuz
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 3/150 2026-02-17 23:40 by tk2gfblvuz
[基金申请] 基金正文30页指的是报告正文还是整个申请书 +3 successhe 2026-02-16 4/200 2026-02-17 20:56 by successhe
[基金申请] 今年春晚有几个节目很不错，点赞！ +5 瞬息宇宙 2026-02-16 6/300 2026-02-17 12:49 by jymy19840415
[微米和纳米] 球磨粉体时遇到了大的问题，请指教！ 10+3 6sbiam 2026-02-12 15/750 2026-02-16 15:03 by tgzxzqj
[基金申请] 过年走亲戚时感受到了所开私家车的鄙视链 +3 瞬息宇宙 2026-02-15 5/250 2026-02-16 14:23 by aspect3000
[硕博家园] 江汉大学解明教授课题组招博士研究生/博士后 +3 cleverlyy 2026-02-12 3/150 2026-02-12 21:02 by qsdf1
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭