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kakaqa

铜虫 (初入文坛)


[交流] 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题

我克隆基因扩增得到了一个3000bp的片段,现在问题来了,我们实验室只有pMD18-T这种载体,听说这种载体连接3000bp的片段有点难度,但也能连上,请教用这种载体连过3000bp条带的高手,连接体系是怎样的,多少度需要连接多久,我已经做了3次了,结果都是失败,相当的郁闷啊!!!
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kakaqa

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by yzuxhq368 at 2010-11-12 20:06:36:
其实不用过夜连。按说明书上的温度,延长几个小时,连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple,3000多的片段。

请问你是16度连的吗。还有载体和插入片段各加了多少微升,谢谢。
6楼2010-11-13 21:17:13
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jackiechubut

木虫 (小有名气)


2200左右的倒是连过,不过没用这个T载体,实在连不上你可以考虑购买其他的T载体连接下。
2楼2010-11-11 21:10:53
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)



amisking(金币+1):鼓励交流! 2010-11-11 21:45:09
3kb有点大,你是用普通TAQ做的吗?最好用高保真酶把产物纯化后再加普通TAQ跟dNTPs 72度半小时,再连pMD18-T 16度反应五六个小时。我实验室有这么做的结果不错。希望你成功。
3楼2010-11-11 21:16:30
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kakaqa

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by lvbobo823 at 2010-11-11 21:16:30:
3kb有点大,你是用普通TAQ做的吗?最好用高保真酶把产物纯化后再加普通TAQ跟dNTPs 72度半小时,再连pMD18-T 16度反应五六个小时。我实验室有这么做的结果不错。希望你成功。

我是用TAKARA的EXtaq做的,连了好多次都连不上,回收的条带很亮,但就是连接不上,真是郁闷死了,我是连接过夜的,现在又做了一次,希望能成功。哎,没办法,就碰运气了,载体本身只有2.7kb,希望这次运气不错。
4楼2010-11-12 08:18:07
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