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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】以连接产物做模板扩增此连接产物，有问题请教各位达人~麻烦您帮忙分析下
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dqvictory

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】以连接产物做模板扩增此连接产物，有问题请教各位达人~麻烦您帮忙分析下 已有6人参与

各位虫友：
      你们好！我这一阶段的实验是先pcr扩增出三条不同的DNA片段（都加了酶切位点），回收，酶切后再回收，用T4DNA连接酶16度连接16个小时，然后以此三段连接产物为模板，用第一个片段的正向引物和第三个片段的反向引物作为引物，扩增这个连接产物。但总得不到理想的结果，非特异性条带较多，目的条带不亮，而且有时没有。请各位帮帮忙分析下！不胜感激！！！
      引物合成报告单上这两个引物的退火温度都是59.1度；G+C含量都是66.7%。连接产物的长度约2200bp。20μl的体系：模板6μl；引物分别2μl；Taq Master Mix 10μl。条件：93度2min；93度30s，58度45s，72度5min，32个循环；72度8min。
      谢谢啦！
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把记忆随身携带！
1楼 2010-05-09 16:50:55
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阿娇

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-09 17:32:10
模板和引物量都太多，估计这就是非特异性带多的原因。
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2楼2010-05-09 17:26:18
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dqvictory

铁虫 (小有名气)
哦~谢谢啦！我减少模板和引物量再试试看
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把记忆随身携带！
3楼2010-05-09 18:50:00
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liudeng821111

木虫 (正式写手)
提高退火温度
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4楼2010-05-09 21:12:33
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
模板浓度不一定要减少，因为连接产物中连上的不会太多，引物可以减少。72度5分钟挺长的。另外，我是做两个片段连接，用femantas的T4酶，发现16度过夜连不如出22度4-6小时效率高。我用22度4小时后做PCR虽然杂条带多，但目的条带挺亮的。
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5楼2010-05-09 21:44:19
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
退火温度要升高，另外引物浓度多少啊？
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6楼2010-05-09 21:48:38
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dqvictory

铁虫 (小有名气)
非常感谢各位虫友，谢谢你们啦！
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把记忆随身携带！
7楼2010-05-09 21:57:21
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临风7071

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
连到载体上在转到大肠杆菌中扩增，然后在酶切下来，这样比你的PCR好多了，而且应该不会有很多问题出现的，毕竟PCR有好多条件要去摸索
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8楼2010-05-09 21:58:06
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dqvictory

铁虫 (小有名气)
引物浓度是10μM
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把记忆随身携带！
9楼2010-05-09 22:04:48
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dqvictory

铁虫 (小有名气)
我做过把这三个片段连到T载体（PMD-18）上的，也没成功过，蛮郁闷的
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把记忆随身携带！
10楼2010-05-09 22:12:02
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