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[交流]
【求助/交流】以连接产物做模板扩增此连接产物，有问题请教各位达人~麻烦您帮忙分析下已有6人参与
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各位虫友： 你们好！我这一阶段的实验是先pcr扩增出三条不同的DNA片段（都加了酶切位点），回收，酶切后再回收，用T4DNA连接酶16度连接16个小时，然后以此三段连接产物为模板，用第一个片段的正向引物和第三个片段的反向引物作为引物，扩增这个连接产物。但总得不到理想的结果，非特异性条带较多，目的条带不亮，而且有时没有。请各位帮帮忙分析下！不胜感激！！！ 引物合成报告单上这两个引物的退火温度都是59.1度；G+C含量都是66.7%。连接产物的长度约2200bp。20μl的体系：模板6μl；引物分别2μl；Taq Master Mix 10μl。条件：93度2min；93度30s，58度45s，72度5min，32个循环；72度8min。 谢谢啦！ |
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