应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题
161/1返回列表
查看: 3361  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

kakaqa

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题

我克隆基因扩增得到了一个3000bp的片段，现在问题来了，我们实验室只有pMD18-T这种载体，听说这种载体连接3000bp的片段有点难度，但也能连上，请教用这种载体连过3000bp条带的高手，连接体系是怎样的，多少度需要连接多久，我已经做了3次了，结果都是失败，相当的郁闷啊！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2010-11-11 18:59:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jackiechubut

木虫 (小有名气)
2200左右的倒是连过，不过没用这个T载体，实在连不上你可以考虑购买其他的T载体连接下。
赞一下 回复此楼
2楼2010-11-11 21:10:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
★
amisking(金币+1):鼓励交流！ 2010-11-11 21:45:09
3kb有点大，你是用普通TAQ做的吗？最好用高保真酶把产物纯化后再加普通TAQ跟dNTPs 72度半小时，再连pMD18-T 16度反应五六个小时。我实验室有这么做的结果不错。希望你成功。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-11-11 21:16:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kakaqa

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lvbobo823 at 2010-11-11 21:16:30:
3kb有点大，你是用普通TAQ做的吗？最好用高保真酶把产物纯化后再加普通TAQ跟dNTPs 72度半小时，再连pMD18-T 16度反应五六个小时。我实验室有这么做的结果不错。希望你成功。

我是用TAKARA的EXtaq做的，连了好多次都连不上，回收的条带很亮，但就是连接不上，真是郁闷死了，我是连接过夜的，现在又做了一次，希望能成功。哎，没办法，就碰运气了，载体本身只有2.7kb，希望这次运气不错。
赞一下 回复此楼
4楼2010-11-12 08:18:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-12 20:25:52
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2010-11-12 20:06:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kakaqa

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yzuxhq368 at 2010-11-12 20:06:36:
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。

请问你是16度连的吗。还有载体和插入片段各加了多少微升，谢谢。
赞一下 回复此楼
6楼2010-11-13 21:17:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yzuxhq368

金虫 (小有名气)
有段时间了，反正是按说明书上的用量和温度，时间记不得了，可能有7-8小时。不过片段浓度和纯度都是用nanodrop测过的，挺好的。260/280在1.8-1.9之间，浓度大概在200左右。
赞一下 回复此楼
7楼2010-11-13 21:53:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yzuxhq368

金虫 (小有名气)
我用的是takara的pMD18T-Simple，载体存放时间也挺长的，用剩的一点点，好像载体用了一微升，solution 1用了5微升，片段加了4微升?
赞一下 回复此楼
8楼2010-11-13 21:59:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zgb1982

木虫 (正式写手)
单纯从连接上讲，不算难连吧，我连过4.3Kb的，4度过夜，10ul体系，测序了，不过存在突变位点。
赞一下 回复此楼
9楼2010-11-13 22:06:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxn2010

木虫 (著名写手)
用的solutin1还是T4连接酶啊？条件要最佳
赞一下 回复此楼
10楼2010-11-13 22:10:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

glannee

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-13 23:51:49
kakaqa(金币+5):恩，好的，我再试试。 2010-11-14 12:33:25
我最大连过6.5k的片段，2次操作就连上了，没有问题。用的是takara的pMD18T-Simple，10微升体系，16℃10小时（或者过夜）。片段浓度大概是100-150ng，基本就按说明书的量操作，
载体用了1微升，
solution 1用了5微升，
片段加了4微升
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2010-11-13 22:53:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by kakaqa at 2010-11-12 08:18:07:



我是用TAKARA的EXtaq做的，连了好多次都连不上，回收的条带很亮，但就是连接不上，真是郁闷死了，我是连接过夜的，现在又做了一次，希望能成功。哎，没办法，就碰运气了，载体本身只有2.7kb，希望这次运气不 ...

放4度过夜试试，我们这有这么连上的，用的载体和酶与你的一样
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2010-11-14 18:08:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-11-14 18:08:13:

放4度过夜试试，我们这有这么连上的，用的载体和酶与你的一样

还有，你加连接产物和载体的时候，最好先定个量，然后按说明书中的比例加
赞一下 回复此楼
13楼2010-11-14 18:09:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

898763077

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2585526&fpage=1
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2010-11-14 18:20:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
T载体不用T4连接的。TAKARA的T载体酶和buffer都是自带的
赞一下(1人) 回复此楼
15楼2010-11-14 19:27:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pushizi

木虫 (小有名气)
这个跟你的基因也有关系的，要是二级结构复杂就难办了
我们实验室一直都用1:3-1:5（摩尔比），4000 bp多的都有连上的，但是有时3kb的也有连不上，送测序都测得费劲，只要你没遇上那种基因，一般连个2小时，转化时感受态效率高点就没事，祝你成功
赞一下 回复此楼
16楼2010-11-14 22:43:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 kakaqa 的主题更新
161/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +9 Tide man 2026-08-10 10/500 2026-08-13 20:33 by 温淼淼淼
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +4 majunge000 2026-08-11 6/300 2026-08-13 16:50 by 四季常青藤
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 好奇怪的filecode +5 布布和一二 2026-08-08 6/300 2026-08-12 16:11 by 云上清扬
[论文投稿] 职称评审，求友友推荐见刊最快的期刊 +4 工厂打螺丝 2026-08-08 4/200 2026-08-12 09:18 by hansi2025
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +7 布布和一二 2026-08-10 10/500 2026-08-12 09:12 by 布布和一二
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭