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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题
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kakaqa

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题

我克隆基因扩增得到了一个3000bp的片段，现在问题来了，我们实验室只有pMD18-T这种载体，听说这种载体连接3000bp的片段有点难度，但也能连上，请教用这种载体连过3000bp条带的高手，连接体系是怎样的，多少度需要连接多久，我已经做了3次了，结果都是失败，相当的郁闷啊！！！
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1楼2010-11-11 18:59:10
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-12 20:25:52
其实不用过夜连。按说明书上的温度，延长几个小时，连接效率很高。我连的是pMD18-T  simple，3000多的片段。
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5楼2010-11-12 20:06:36
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
有段时间了，反正是按说明书上的用量和温度，时间记不得了，可能有7-8小时。不过片段浓度和纯度都是用nanodrop测过的，挺好的。260/280在1.8-1.9之间，浓度大概在200左右。
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7楼2010-11-13 21:53:17
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
我用的是takara的pMD18T-Simple，载体存放时间也挺长的，用剩的一点点，好像载体用了一微升，solution 1用了5微升，片段加了4微升?
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8楼2010-11-13 21:59:15
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
T载体不用T4连接的。TAKARA的T载体酶和buffer都是自带的
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15楼2010-11-14 19:27:18
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