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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】TA克隆
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lij2

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】TA克隆 已有2人参与

我用的载体是PGM-T，3000多bp，连的也是3000多bp的一段基因，是胶回收的，没有其他片段。可是挑白色菌落提出的质粒单酶切电泳只有4000多bp。请教高人，是怎么回事啊？
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1楼 2010-09-26 17:18:43
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diaoyuhua

金虫 (小有名气)
生物实验有时很诡异，重复次试试
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2楼2010-09-26 17:33:25
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lij2

金虫 (小有名气)
amisking:严禁纯表情发帖交流！ 2010-09-26 20:18:52
3楼2010-09-26 19:52:46
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shan-sa

金虫 (正式写手)
偶前几天刚连了个3000的，挺好滴，楼主看看单酶切的位点是不是出了问题
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4楼2010-09-26 19:57:34
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oyanxuelai

银虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-09-26 20:19:15
你那目的基因是用PCR扩出来吗?如果是的话,用tag酶扩的直接连接上载体就行;若用高保真的,则要加A尾巴,再连上载体!载体本身也可以自连.虽然做转化后长出菌,然后提质粒,再酶切,一般会出现两种情况:一种载体自连;一种是载体与目的基因连接上的.
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5楼2010-09-26 20:01:20
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lij2

金虫 (小有名气)
我用的taq plus
问题在怎么出了个4000多bp的片段
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6楼2010-09-26 20:24:50
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oyanxuelai

银虫 (小有名气)
lij2(金币+1): 2010-09-28 21:49:43
有可能是连接上载体.但是你的载体和目的基因可能含有多个酶切位点.你用的酶所识别的酶切位点有很多个,虽然单酶切,其结果会切成一个4000片段和好多个小片段!而小片段可能在电泳中看不到的
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7楼2010-09-27 11:19:02
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lij2

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by oyanxuelai at 2010-09-27 11:19:02:
有可能是连接上载体.但是你的载体和目的基因可能含有多个酶切位点.你用的酶所识别的酶切位点有很多个,虽然单酶切,其结果会切成一个4000片段和好多个小片段!而小片段可能在电泳中看不到的

载体上只有一个我用的酶的酶切位点，目的基因上也只有一个，不管连的方向如何，都不该出现4000多的片段啊
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8楼2010-09-27 11:39:52
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oyanxuelai

银虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-09-30 07:17:55
哦,是这样咯!那按你说的两个酶切位点,结果应该有两条带,一条是4000多片段,一条是1500左右的片段.所以出现4000多的片段是很正常的.
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9楼2010-09-27 16:33:15
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
lij2(金币+1): 2010-09-28 21:50:00
直接用菌液PCR不行吗？我从来不提质粒也不酶切的，直接用目的基因的引物做菌液PCR，检测白色菌落是否是阳性的，然后送该菌液测序就行了，测序结果是从序列中可以把上下游引物序列都找到，就把目的片段拿NCBI比对，是那个基因就对了
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
10楼2010-09-27 19:35:50
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