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lij2

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】TA克隆 已有2人参与

我用的载体是PGM-T,3000多bp,连的也是3000多bp的一段基因,是胶回收的,没有其他片段。可是挑白色菌落提出的质粒单酶切电泳只有4000多bp。请教高人,是怎么回事啊?
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diaoyuhua

金虫 (小有名气)

生物实验有时很诡异,重复次试试
2楼2010-09-26 17:33:25
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lij2

金虫 (小有名气)

amisking:严禁纯表情发帖交流! 2010-09-26 20:18:52
3楼2010-09-26 19:52:46
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shan-sa

金虫 (正式写手)

偶前几天刚连了个3000的,挺好滴,楼主看看单酶切的位点是不是出了问题
4楼2010-09-26 19:57:34
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oyanxuelai

银虫 (小有名气)

★ ★
amisking(金币+2):鼓励交流! 2010-09-26 20:19:15
你那目的基因是用PCR扩出来吗?如果是的话,用tag酶扩的直接连接上载体就行;若用高保真的,则要加A尾巴,再连上载体!载体本身也可以自连.虽然做转化后长出菌,然后提质粒,再酶切,一般会出现两种情况:一种载体自连;一种是载体与目的基因连接上的.
5楼2010-09-26 20:01:20
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lij2

金虫 (小有名气)

我用的taq plus
问题在怎么出了个4000多bp的片段
6楼2010-09-26 20:24:50
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oyanxuelai

银虫 (小有名气)

lij2(金币+1): 2010-09-28 21:49:43
有可能是连接上载体.但是你的载体和目的基因可能含有多个酶切位点.你用的酶所识别的酶切位点有很多个,虽然单酶切,其结果会切成一个4000片段和好多个小片段!而小片段可能在电泳中看不到的
7楼2010-09-27 11:19:02
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lij2

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by oyanxuelai at 2010-09-27 11:19:02:
有可能是连接上载体.但是你的载体和目的基因可能含有多个酶切位点.你用的酶所识别的酶切位点有很多个,虽然单酶切,其结果会切成一个4000片段和好多个小片段!而小片段可能在电泳中看不到的

载体上只有一个我用的酶的酶切位点,目的基因上也只有一个,不管连的方向如何,都不该出现4000多的片段啊
8楼2010-09-27 11:39:52
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oyanxuelai

银虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-09-30 07:17:55
哦,是这样咯!那按你说的两个酶切位点,结果应该有两条带,一条是4000多片段,一条是1500左右的片段.所以出现4000多的片段是很正常的.
9楼2010-09-27 16:33:15
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

lij2(金币+1): 2010-09-28 21:50:00
直接用菌液PCR不行吗?我从来不提质粒也不酶切的,直接用目的基因的引物做菌液PCR,检测白色菌落是否是阳性的,然后送该菌液测序就行了,测序结果是从序列中可以把上下游引物序列都找到,就把目的片段拿NCBI比对,是那个基因就对了
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
10楼2010-09-27 19:35:50
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