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dhmdddd

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[求助] 请教关于宝公司pMD18T连接问题

用pMD18T连接PCR产物，老是连不上，最开始只知道利用的是polyA和载体上的T连接起来，今天看了看T载的说明书感到有点小疑惑，连接做了几次，单跑质粒的后就是话感觉大小是对的，但是酶切后面再看就不对了，这是不是压根就没有连上？还是什么情况？求解释……补充一下，我的目的基因两边的酶切位点是EcoR I 和BamH I

[ Last edited by dhmdddd on 2011-4-26 at 15:51 ]

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上班族，学习ing……

1楼 2011-04-26 15:16:39

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susizheng

木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

dhmdddd(金币+1): 我用的加酶有加A，但是后面连的时候总是问题…… 2011-04-26 18:38:14

不是ployA，是DNA聚合酶扩增时能在PCR产物5‘端加上一个A。
因此做TA克隆，先看看你用的酶有没有加A功能。

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Thank-you，so-blue.

2楼2011-04-26 16:37:43

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liu_juan82

金虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 很积极，很热心~~ 2011-04-26 22:55:14
dhmdddd(金币+3): 十分感谢，那就应该是没有连上，后面酶切验证的时候没有我目的基因大小的片段！ 2011-04-27 13:23:22

引用回帖:

Originally posted by dhmdddd at 2011-04-26 15:16:39:
用pMD18T连接PCR产物，老是连不上，最开始只知道利用的是polyA和载体上的T连接起来，今天看了看T载的说明书感到有点小疑惑，连接做了几次，单跑质粒的后就是话感觉大小是对的，但是酶切后面再看就不对了，这是不是 ...

首先，如楼上所说，T载体连接依据的是taq酶能够在扩增片段的末端加A，而载体的末端被认为加上T，两者配对连接的。如果你的酶不能在片段末端加A，肯定不能和载体连接。
再次，质粒一般是环形的，提取的质粒，线性的几乎很少。而你在电泳的时候，所用的评判质粒大小的是线性的DNA marker，所以用电泳的方式验证质粒是否连接上是不可靠的。判断质粒是否是阳性的一般用PCR结合双酶切进行验证。
第三，质粒连接的效率还取决于连接体系中载体和插入片段的摩尔比例。T载体推荐的是载体：DNA=1：2~1:10,我平时一般用1：5左右，基本不会出现连接不上的问题。
希望上述解释能帮助你。

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3楼2011-04-26 21:21:16

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