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【求助/交流】RFLP实验中菌落PCR分析
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凌-强
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[交流]
【求助/交流】RFLP实验中菌落PCR分析
我最近在做RFLP,前一步提取了总DNA,现在回收了,连接到PMD-18T载体上,转化到JM109上,然后我挑了单个克隆划线后,我做了菌落PCR,但是跑出来全是阴性,请各位帮找下原因,不应该全是阴性啊
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2010-12-20 17:04:21
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amisking(金币+2):鼓励发帖交流! 2010-12-20 20:51:50
你连总DNA到载体上??你确定不是总DNA提取后然后扩增目的基因,然后再连接至载体??
或许我误解你的意思了,最好能再写详细一些。
[
Last edited by brightfuture01 on 2010-12-20 at 17:07
]
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2010-12-20 17:05:55
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lstt09nk(金币+1):是的,通常鉴定的话,PCR只是做个参考 2010-12-20 17:17:50
凌-强(金币+1):谢谢哦,给点意见 2010-12-21 20:25:30
可以送一个克隆去测序看看有没有插入片段,虽然菌落PCR挺容易出假阳性的,但是从另一个侧面也说明了有时不是很可靠
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3楼
2010-12-20 17:09:59
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amisking(金币+3):欢迎分享经验。 2010-12-20 20:52:10
凌-强(金币+1):谢谢参与,帮忙了 2010-12-21 20:25:46
我的经验不是这样的,以前经常在做转化后的鉴定,因为再扩体积提质粒还要半天时间,通常就会做菌落PCR,结果都是可以在5个左右出来一个阳性克隆的,最多的我们实验室有个同学做了48个菌落,也有2-3个阳性的。我想是不是你的工程菌有问题?或者,酶切后哪里出现了问题?切胶回收的滤柱的截留分子量会不会太小,把目的片段给滤掉了?
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2010-12-20 19:27:44
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Originally posted by
brightfuture01
at 2010-12-20 17:05:55:
你连总DNA到载体上??你确定不是总DNA提取后然后扩增目的基因,然后再连接至载体??
或许我误解你的意思了,最好能再写详细一些。
[
Last edited by brightfuture01 on 2010-12-20 at 17:07
]
没有说清楚,是链接的16SrDNA,我提取了DNA之后,用通用引物扩增的16SrDNA,然后再回收,链接的
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5楼
2010-12-21 20:23:05
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宁夏8083
at 2010-12-20 19:27:44:
我的经验不是这样的,以前经常在做转化后的鉴定,因为再扩体积提质粒还要半天时间,通常就会做菌落PCR,结果都是可以在5个左右出来一个阳性克隆的,最多的我们实验室有个同学做了48个菌落,也有2-3个阳性的。我想 ...
我回收后检测了,我的目的片段是完整的,我现在只是做到挑单个菌落划线,然后做菌落PCR,就到这里,检测阳性克隆,但是做了25个了,全部都是阴性克隆,所以怀疑是不是没有连接上。
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2010-12-21 20:25:15
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Originally posted by
凌-强
at 2010-12-21 20:25:15:
我回收后检测了,我的目的片段是完整的,我现在只是做到挑单个菌落划线,然后做菌落PCR,就到这里,检测阳性克隆,但是做了25个了,全部都是阴性克隆,所以怀疑是不是没有连接上。
挑几个克隆去测序吧,这个能说明问题。每个克隆测一个反应就OK了。
还有就是你的这个T载体连接的试剂盒可能不是很好,建议用fermentas的那款试剂盒或者promega的那款,这两个T载体制备比较好,白斑95%以上,基本上都有插入片段。
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7楼
2010-12-21 21:26:26
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