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凌-强

银虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】RFLP实验中菌落PCR分析

我最近在做RFLP,前一步提取了总DNA,现在回收了,连接到PMD-18T载体上,转化到JM109上,然后我挑了单个克隆划线后,我做了菌落PCR,但是跑出来全是阴性,请各位帮找下原因,不应该全是阴性啊
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凌-强

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-20 17:05:55:
你连总DNA到载体上??你确定不是总DNA提取后然后扩增目的基因,然后再连接至载体??

或许我误解你的意思了,最好能再写详细一些。

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-20 at 17:07 ]

没有说清楚,是链接的16SrDNA,我提取了DNA之后,用通用引物扩增的16SrDNA,然后再回收,链接的
5楼2010-12-21 20:23:05
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★ ★
amisking(金币+2):鼓励发帖交流! 2010-12-20 20:51:50
你连总DNA到载体上??你确定不是总DNA提取后然后扩增目的基因,然后再连接至载体??

或许我误解你的意思了,最好能再写详细一些。

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-20 at 17:07 ]
2楼2010-12-20 17:05:55
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lstt09nk(金币+1):是的,通常鉴定的话,PCR只是做个参考 2010-12-20 17:17:50
凌-强(金币+1):谢谢哦,给点意见 2010-12-21 20:25:30
可以送一个克隆去测序看看有没有插入片段,虽然菌落PCR挺容易出假阳性的,但是从另一个侧面也说明了有时不是很可靠
3楼2010-12-20 17:09:59
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宁夏8083

铁杆木虫 (正式写手)


★ ★ ★
amisking(金币+3):欢迎分享经验。 2010-12-20 20:52:10
凌-强(金币+1):谢谢参与,帮忙了 2010-12-21 20:25:46
我的经验不是这样的,以前经常在做转化后的鉴定,因为再扩体积提质粒还要半天时间,通常就会做菌落PCR,结果都是可以在5个左右出来一个阳性克隆的,最多的我们实验室有个同学做了48个菌落,也有2-3个阳性的。我想是不是你的工程菌有问题?或者,酶切后哪里出现了问题?切胶回收的滤柱的截留分子量会不会太小,把目的片段给滤掉了?
4楼2010-12-20 19:27:44
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