应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RFLP实验中菌落PCR分析
51/1返回列表
查看: 1224  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

凌-强

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】RFLP实验中菌落PCR分析

我最近在做RFLP，前一步提取了总DNA，现在回收了，连接到PMD-18T载体上，转化到JM109上，然后我挑了单个克隆划线后，我做了菌落PCR,但是跑出来全是阴性，请各位帮找下原因，不应该全是阴性啊
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2010-12-20 17:04:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by 凌-强 at 2010-12-21 20:25:15:




我回收后检测了，我的目的片段是完整的，我现在只是做到挑单个菌落划线，然后做菌落PCR，就到这里，检测阳性克隆，但是做了25个了，全部都是阴性克隆，所以怀疑是不是没有连接上。

挑几个克隆去测序吧，这个能说明问题。每个克隆测一个反应就OK了。

还有就是你的这个T载体连接的试剂盒可能不是很好，建议用fermentas的那款试剂盒或者promega的那款，这两个T载体制备比较好，白斑95%以上，基本上都有插入片段。
赞一下 回复此楼
7楼2010-12-21 21:26:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
amisking(金币+2):鼓励发帖交流！ 2010-12-20 20:51:50
你连总DNA到载体上？？你确定不是总DNA提取后然后扩增目的基因，然后再连接至载体？？

或许我误解你的意思了，最好能再写详细一些。

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-20 at 17:07 ]
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2010-12-20 17:05:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
lstt09nk(金币+1):是的，通常鉴定的话，PCR只是做个参考 2010-12-20 17:17:50
凌-强(金币+1):谢谢哦，给点意见 2010-12-21 20:25:30
可以送一个克隆去测序看看有没有插入片段，虽然菌落PCR挺容易出假阳性的，但是从另一个侧面也说明了有时不是很可靠
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-12-20 17:09:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

宁夏8083

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3):欢迎分享经验。 2010-12-20 20:52:10
凌-强(金币+1):谢谢参与，帮忙了 2010-12-21 20:25:46
我的经验不是这样的，以前经常在做转化后的鉴定，因为再扩体积提质粒还要半天时间，通常就会做菌落PCR，结果都是可以在5个左右出来一个阳性克隆的，最多的我们实验室有个同学做了48个菌落，也有2-3个阳性的。我想是不是你的工程菌有问题？或者，酶切后哪里出现了问题？切胶回收的滤柱的截留分子量会不会太小，把目的片段给滤掉了？
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-12-20 19:27:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭