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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RFLP实验中菌落PCR分析
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凌-强

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】RFLP实验中菌落PCR分析

我最近在做RFLP，前一步提取了总DNA，现在回收了，连接到PMD-18T载体上，转化到JM109上，然后我挑了单个克隆划线后，我做了菌落PCR,但是跑出来全是阴性，请各位帮找下原因，不应该全是阴性啊
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1楼 2010-12-20 17:04:21
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
amisking(金币+2):鼓励发帖交流！ 2010-12-20 20:51:50
你连总DNA到载体上？？你确定不是总DNA提取后然后扩增目的基因，然后再连接至载体？？

或许我误解你的意思了，最好能再写详细一些。

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-20 at 17:07 ]
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2楼2010-12-20 17:05:55
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
lstt09nk(金币+1):是的，通常鉴定的话，PCR只是做个参考 2010-12-20 17:17:50
凌-强(金币+1):谢谢哦，给点意见 2010-12-21 20:25:30
可以送一个克隆去测序看看有没有插入片段，虽然菌落PCR挺容易出假阳性的，但是从另一个侧面也说明了有时不是很可靠
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3楼2010-12-20 17:09:59
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宁夏8083

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3):欢迎分享经验。 2010-12-20 20:52:10
凌-强(金币+1):谢谢参与，帮忙了 2010-12-21 20:25:46
我的经验不是这样的，以前经常在做转化后的鉴定，因为再扩体积提质粒还要半天时间，通常就会做菌落PCR，结果都是可以在5个左右出来一个阳性克隆的，最多的我们实验室有个同学做了48个菌落，也有2-3个阳性的。我想是不是你的工程菌有问题？或者，酶切后哪里出现了问题？切胶回收的滤柱的截留分子量会不会太小，把目的片段给滤掉了？
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4楼2010-12-20 19:27:44
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凌-强

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-20 17:05:55:
你连总DNA到载体上？？你确定不是总DNA提取后然后扩增目的基因，然后再连接至载体？？

或许我误解你的意思了，最好能再写详细一些。

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-20 at 17:07 ]

没有说清楚，是链接的16SrDNA，我提取了DNA之后，用通用引物扩增的16SrDNA，然后再回收，链接的
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5楼2010-12-21 20:23:05
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凌-强

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 宁夏8083 at 2010-12-20 19:27:44:
我的经验不是这样的，以前经常在做转化后的鉴定，因为再扩体积提质粒还要半天时间，通常就会做菌落PCR，结果都是可以在5个左右出来一个阳性克隆的，最多的我们实验室有个同学做了48个菌落，也有2-3个阳性的。我想 ...

我回收后检测了，我的目的片段是完整的，我现在只是做到挑单个菌落划线，然后做菌落PCR，就到这里，检测阳性克隆，但是做了25个了，全部都是阴性克隆，所以怀疑是不是没有连接上。
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6楼2010-12-21 20:25:15
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by 凌-强 at 2010-12-21 20:25:15:




我回收后检测了，我的目的片段是完整的，我现在只是做到挑单个菌落划线，然后做菌落PCR，就到这里，检测阳性克隆，但是做了25个了，全部都是阴性克隆，所以怀疑是不是没有连接上。

挑几个克隆去测序吧，这个能说明问题。每个克隆测一个反应就OK了。

还有就是你的这个T载体连接的试剂盒可能不是很好，建议用fermentas的那款试剂盒或者promega的那款，这两个T载体制备比较好，白斑95%以上，基本上都有插入片段。
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7楼2010-12-21 21:26:26
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