应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于转化、菌落PCR
91/1返回列表
查看: 2624  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

fengzheng770

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于转化、菌落PCR

大家好，有个问题向大家求助。
最近做实验遇到的问题：将某基因和真核表达载体连接，然后转化DH5α，涂含合适抗生素的培养皿，第二天长出一些菌落，挑单菌落划板，同时菌落PCR（用的之前扩增基因的上下游引物），挑选菌落PCR阳性的克隆，接种到含有合适的抗生素的LB中摇菌过夜，第二天，菌液浑浊，然后提质粒，双酶切鉴定，竟然没有条带，用提出的质粒电泳，也没有任何条带。如果是假阳性的话（引物用扩增基因的引物容易假阳性），为什么在含有抗生素的LB培养基中摇菌能长出很多菌来？如果是真阳性克隆，为什么又没有质粒？而且确定双酶切用的酶是没有问题的。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-11-07 18:32:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

misshome

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
amisking(金币+4, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-11-07 20:07:09
fengzheng770(金币+2): 2011-11-16 15:03:23
1.确定PCR的体系没有问题，阴性对照没有条带，过程中无污染。
PCR鉴定的准确性不是很高。
2.至于在抗生素的培养基上能长，可能污染了有杂菌，换个感受态；
也有可能抗生素失效了，一般这个可能比较小。
赞一下(1人) 回复此楼
做开心快乐阳光的自己
2楼2011-11-07 19:27:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

fengzheng770(金币+2): 2011-11-16 15:03:31
我也遇到过这种情况。
最大的可能就是你转化后涂布培养的时间过长，长出来的菌几乎都是假阳性（卫星菌落）。
平板37度培养时，抗生素（以氨苄为例）只能保持效力16小时左右。培养时间超过这个时间，以后长出来的菌就不能算数了。
转化的效率本身就比较低的，涂一次板能长出5、6个就不错了。培养时间够长了要是还没出现菌落的话，就果断重新转化吧。

最后祝实验顺利。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-11-07 20:21:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户

【答案】应助回帖

fengzheng770(金币+1): 2011-11-16 15:03:34
转化过程对照要做好，不然真的不确定长出来的是神马。
PCR的对照也要带上，提出的质粒做模板再做次PCR试试，有可能提取过程中丢了导致量很少也说不定，质粒也电泳检测一下再做酶切，带上对照。
赞一下 回复此楼
金币是赌出来的
4楼2011-11-08 10:14:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liaotiantian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 这个挺正常的，假阳性嘛……………… 2011-11-09 12:16:16
我最近也遇到的同样的问题，挑单菌落PCR阳性的转化子，提质粒酶切就是啥也没有，上样的时候用质粒做对照质粒是有的，大小也差不多，连着做了两次连接转化结果都一样。真是不知道咋回事了
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-11-08 22:16:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

樱花有泪

银虫 (小有名气)
我最近试验也遇到类似的问题：PCR用的KOD酶扩增的，胶回收后再加A，并且电泳显示仍有很强的亮度。做TA克隆，每板能长出20个左右的克隆，做蓝白筛选，白斑10个以下，菌P全无条带。
赞一下 回复此楼
6楼2012-09-24 20:02:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xjtu0025

新虫 (小有名气)
我觉得只有酶切实在是不合适鉴定的时候才需要用菌落PCR吧.最好也是用质粒的引物,这样防止假阳性.

我载体6000bp,目的片段300bp,拿10ug质粒切啊,能浅浅的看到一小条带就很开心了..所以采用菌落PCR法,省时间省试剂盒省酶..反正最后都要测序的..测序才准吧..
赞一下 回复此楼
7楼2013-05-24 19:16:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰风颤木

金虫 (正式写手)
我的一般是长的菌落很少 你这个长的挺动的啊
赞一下 回复此楼
船到桥头自然直
8楼2013-06-12 17:12:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

咯喵咯喵

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 樱花有泪 at 2012-09-24 20:02:32
我最近试验也遇到类似的问题：PCR用的KOD酶扩增的，胶回收后再加A，并且电泳显示仍有很强的亮度。做TA克隆，每板能长出20个左右的克隆，做蓝白筛选，白斑10个以下，菌P全无条带。

我也是啊，不知您解决了没有？
赞一下 回复此楼
9楼2015-04-19 21:47:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 fengzheng770 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 330求调剂 +3 ?酱给调剂跪了 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:13 by JourneyLucky
[考研] 328，0703考生求调剂，一志愿为东北师范大学 +4 观素律 2026-03-09 5/250 2026-03-14 01:24 by JourneyLucky
[考研] 云南财经大学信息学院计算机学硕专硕学位点 +3 zjptai 2026-03-10 5/250 2026-03-14 01:23 by 飞行琦
[考研] 考研材料与化工，求调剂 +8 戏精丹丹丹 2026-03-09 8/400 2026-03-14 01:14 by JourneyLucky
[考研] 一志愿安徽大学材料工程专硕313分，求调剂的学校 +8 Yu先生 2026-03-10 10/500 2026-03-14 01:04 by JourneyLucky
[考研] 四川大学085601材料工程专硕 初试294求调剂 +4 祝我们好在冬天 2026-03-11 4/200 2026-03-13 21:39 by peike
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
[硕博家园] 深圳大学硕士招生（2026秋，传感器方向，仅录取第一志愿） +4 xujiaoszu 2026-03-11 7/350 2026-03-13 17:28 by xujiaoszu
[考研] 【0856】化学工程（085602）313 分，本科学科评估A类院校化学工程与工艺，诚求调剂 +7 小刘快快上岸 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:06 by ruiyingmiao
[考研] 285求调剂 +4 ytter 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:48 by jxchenghu
[考研] 289求调剂 +3 李政莹 2026-03-12 3/150 2026-03-13 11:02 by 求调剂zz
[考研] 268求调剂 +4 好运连绵不绝 2026-03-12 4/200 2026-03-13 10:45 by hyswxzs
[考研] 化工学硕306求调剂 +9 42838695 2026-03-12 9/450 2026-03-13 10:16 by houyaoxu
[考研] 333求调剂 +3 152697 2026-03-12 4/200 2026-03-13 07:08 by Iveryant
[考博] 2026年博士申请 +3 QwQwQW10 2026-03-11 3/150 2026-03-12 17:58 by gxch43
[考研] 279求调剂 +3 莫xiao 2026-03-10 4/200 2026-03-11 08:06 by 斩魂滴兔子！
[考研] 化工0817调剂 +8 灿若星晨 2026-03-10 8/400 2026-03-10 22:44 by 星空星月
[考研] 0703化学调剂 +3 三dd. 2026-03-10 3/150 2026-03-10 15:45 by peike
[考研] 一志愿：武汉理工，材料工程，英二数二 总分314 +3 2202020125 2026-03-10 4/200 2026-03-10 13:54 by xiongyaxuan
[考研] 家人们 调剂不迷路 看这里 +8 likeihood 2026-03-09 13/650 2026-03-10 08:09 by likeihood
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭