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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于转化、菌落PCR
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fengzheng770

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于转化、菌落PCR

大家好，有个问题向大家求助。
最近做实验遇到的问题：将某基因和真核表达载体连接，然后转化DH5α，涂含合适抗生素的培养皿，第二天长出一些菌落，挑单菌落划板，同时菌落PCR（用的之前扩增基因的上下游引物），挑选菌落PCR阳性的克隆，接种到含有合适的抗生素的LB中摇菌过夜，第二天，菌液浑浊，然后提质粒，双酶切鉴定，竟然没有条带，用提出的质粒电泳，也没有任何条带。如果是假阳性的话（引物用扩增基因的引物容易假阳性），为什么在含有抗生素的LB培养基中摇菌能长出很多菌来？如果是真阳性克隆，为什么又没有质粒？而且确定双酶切用的酶是没有问题的。
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1楼 2011-11-07 18:32:43
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misshome

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
amisking(金币+4, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-11-07 20:07:09
fengzheng770(金币+2): 2011-11-16 15:03:23
1.确定PCR的体系没有问题，阴性对照没有条带，过程中无污染。
PCR鉴定的准确性不是很高。
2.至于在抗生素的培养基上能长，可能污染了有杂菌，换个感受态；
也有可能抗生素失效了，一般这个可能比较小。
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做开心快乐阳光的自己
2楼2011-11-07 19:27:18
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

fengzheng770(金币+2): 2011-11-16 15:03:31
我也遇到过这种情况。
最大的可能就是你转化后涂布培养的时间过长，长出来的菌几乎都是假阳性（卫星菌落）。
平板37度培养时，抗生素（以氨苄为例）只能保持效力16小时左右。培养时间超过这个时间，以后长出来的菌就不能算数了。
转化的效率本身就比较低的，涂一次板能长出5、6个就不错了。培养时间够长了要是还没出现菌落的话，就果断重新转化吧。

最后祝实验顺利。
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3楼2011-11-07 20:21:25
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户

【答案】应助回帖

fengzheng770(金币+1): 2011-11-16 15:03:34
转化过程对照要做好，不然真的不确定长出来的是神马。
PCR的对照也要带上，提出的质粒做模板再做次PCR试试，有可能提取过程中丢了导致量很少也说不定，质粒也电泳检测一下再做酶切，带上对照。
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金币是赌出来的
4楼2011-11-08 10:14:25
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liaotiantian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 这个挺正常的，假阳性嘛……………… 2011-11-09 12:16:16
我最近也遇到的同样的问题，挑单菌落PCR阳性的转化子，提质粒酶切就是啥也没有，上样的时候用质粒做对照质粒是有的，大小也差不多，连着做了两次连接转化结果都一样。真是不知道咋回事了
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5楼2011-11-08 22:16:44
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樱花有泪

银虫 (小有名气)
我最近试验也遇到类似的问题：PCR用的KOD酶扩增的，胶回收后再加A，并且电泳显示仍有很强的亮度。做TA克隆，每板能长出20个左右的克隆，做蓝白筛选，白斑10个以下，菌P全无条带。
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6楼2012-09-24 20:02:32
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
我觉得只有酶切实在是不合适鉴定的时候才需要用菌落PCR吧.最好也是用质粒的引物,这样防止假阳性.

我载体6000bp,目的片段300bp,拿10ug质粒切啊,能浅浅的看到一小条带就很开心了..所以采用菌落PCR法,省时间省试剂盒省酶..反正最后都要测序的..测序才准吧..
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7楼2013-05-24 19:16:41
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冰风颤木

金虫 (正式写手)
我的一般是长的菌落很少 你这个长的挺动的啊
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船到桥头自然直
8楼2013-06-12 17:12:09
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咯喵咯喵

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 樱花有泪 at 2012-09-24 20:02:32
我最近试验也遇到类似的问题：PCR用的KOD酶扩增的，胶回收后再加A，并且电泳显示仍有很强的亮度。做TA克隆，每板能长出20个左右的克隆，做蓝白筛选，白斑10个以下，菌P全无条带。

我也是啊，不知您解决了没有？
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9楼2015-04-19 21:47:33
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