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fengzheng770

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 关于转化、菌落PCR

大家好，有个问题向大家求助。
最近做实验遇到的问题：将某基因和真核表达载体连接，然后转化DH5α，涂含合适抗生素的培养皿，第二天长出一些菌落，挑单菌落划板，同时菌落PCR（用的之前扩增基因的上下游引物），挑选菌落PCR阳性的克隆，接种到含有合适的抗生素的LB中摇菌过夜，第二天，菌液浑浊，然后提质粒，双酶切鉴定，竟然没有条带，用提出的质粒电泳，也没有任何条带。如果是假阳性的话（引物用扩增基因的引物容易假阳性），为什么在含有抗生素的LB培养基中摇菌能长出很多菌来？如果是真阳性克隆，为什么又没有质粒？而且确定双酶切用的酶是没有问题的。

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1楼2011-11-07 18:32:43

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misshome

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
amisking(金币+4, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-11-07 20:07:09
fengzheng770(金币+2): 2011-11-16 15:03:23

1.确定PCR的体系没有问题，阴性对照没有条带，过程中无污染。
PCR鉴定的准确性不是很高。
2.至于在抗生素的培养基上能长，可能污染了有杂菌，换个感受态；
也有可能抗生素失效了，一般这个可能比较小。

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做开心快乐阳光的自己

2楼2011-11-07 19:27:18

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jingdejun

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【答案】应助回帖

fengzheng770(金币+2): 2011-11-16 15:03:31

我也遇到过这种情况。
最大的可能就是你转化后涂布培养的时间过长，长出来的菌几乎都是假阳性（卫星菌落）。
平板37度培养时，抗生素（以氨苄为例）只能保持效力16小时左右。培养时间超过这个时间，以后长出来的菌就不能算数了。
转化的效率本身就比较低的，涂一次板能长出5、6个就不错了。培养时间够长了要是还没出现菌落的话，就果断重新转化吧。