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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌落PCR结果（望高手进来拆招……本人第一次做TA克隆，么经验）
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jen1006

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌落PCR结果（望高手进来拆招……本人第一次做TA克隆，么经验） 已有9人参与


直接加单克隆菌液于普通PCR体系，M13载体通用引物，普通PCR程序，结果于照片，目的带690bp。不知道原因，是不是假阳性啊这个样子？

[ Last edited by jen1006 on 2011-1-10 at 10:37 ]
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1楼 2011-01-10 10:36:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

绿色荧光蛋白

木虫 (正式写手)

至尊木虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
哎，还是某来帮你解答下吧，看了这么多人回答都不靠谱啊，呵呵。

若用菌液做PCR快速筛选真转化子，方法是这样子的，记住了啊：取菌液50 uL-100 uL，盖紧盖子，用PARAFILM膜封好，这样做事防止加热过程中管口蹦开。然后，沸水浴5分钟后高速离心2-3分钟，取上清液为模板DNA，再行PCR即可。

你做的结果是非特异性扩增，是由于模板DNA纯度不够所致。也就是你做的PCR扩增是失败的。
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9楼2011-01-11 21:41:34
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普通回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★
dhd997(金币+3):谢谢交流 2011-01-10 16:43:34
貌似这几个在倒数第三条带（marker）附近都有带，不知道在maker上是多少bp。

别重复了，直接挑两个白斑提质粒做下酶切（前提是多克隆位点上有合适的site）。

你的菌液是不是加多了？多大的PCR体系,加了多少ul菌液？
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-01-10 10:43:54
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
690bp，可以直接挑克隆送去测序了。一个反应23块钱，你在这儿做来做去时间也花了不少，酶用了不少，不划算。呵呵。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-01-10 10:56:12
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

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优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
非特异性产物不除，答案不解
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4楼2011-01-10 11:50:39
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real339

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
只要条带中有你要的条带，就再进行个酶切检测就O了。PCR本来就不太准确的。
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天下没有免费的午餐
5楼2011-01-10 12:00:43
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姜大磊

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
提质粒在PCR或者酶切一次吧，更能验证！
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Nevergiveup,neverslowdown;Nevergrowold,nevereverdieyoung......
6楼2011-01-10 14:23:35
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
提质粒做酶切，可能不是单克隆聚落。猜测可能是纯化的时候没弄好也没连好吧。
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7楼2011-01-10 16:01:05
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jen1006

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-10 10:43:54:
貌似这几个在倒数第三条带（marker）附近都有带，不知道在maker上是多少bp。

别重复了，直接挑两个白斑提质粒做下酶切（前提是多克隆位点上有合适的site）。

你的菌液是不是加多了？多大的PCR体系,加了多少 ...

谢谢诶，我重新再做次！
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8楼2011-01-11 15:03:52
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CHONPaS

金虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
其实也不需要像楼上的那样麻烦
直接将菌落加入PCR体系即可，前面变性的时间长点，10分钟就可以了
P出来的主要的还是你的条带，或者楼主可以用质粒上的引物
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10楼2011-01-11 23:41:28
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