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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于基因敲除
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于基因敲除 已有5人参与

最近在做大肠基因敲除，转化的是PCR产物，是DNA片段，2000Kb多点，转化后，平板上有菌落长出来，接摇瓶转化子也长，同样的抗生素浓度下转化前的菌株不长，这可以说明转化子表现抗性吧？但是验证PCR时，P出来的条带总是在一条线上，也就是说没有重组上，感觉很奇怪，不知道各位有没有遇到这种情况，这到底是什么原因，转化进去片段应该不会表达的吧？不知道我有没有把问题说清楚，请高手指教！！先谢过了！！
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上班族，学习ing……
1楼 2010-06-10 09:30:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
也遇到同样的问题啊，做酵母基因敲除，转进了抗性基因，能耐受很高的抗生素浓度，PCR验证却做不出来。
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Thank-you，so-blue.
2楼2010-06-10 10:00:08
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临风7071

木虫 (正式写手)
dhmdddd(金币+1):谢谢！酶切试试看！ 2010-06-10 12:03:59
做酶切验证，那是最准确的方法。另外，你PCR时应该做阳性对照，以验证是否是PCR的问题
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3楼2010-06-10 10:05:44
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 临风7071 at 2010-06-10 10:05:44:
做酶切验证，那是最准确的方法。另外，你PCR时应该做阳性对照，以验证是否是PCR的问题

PCR我做了一个未转化菌株的对照，P出来的条带和转化子P出的条带在在一条带上，我点样时加了一个Marker，结果是全部都没有到2000K，这个应该可以说明PCR没有问题的吧？
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上班族，学习ing……
4楼2010-06-10 12:19:46
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鹏飞九万里

新虫 (初入文坛)
你的pcr片段大小是不是和你要敲除的基因片段大小差不多？
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5楼2010-06-10 12:25:31
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 鹏飞九万里 at 2010-06-10 12:25:31:
你的pcr片段大小是不是和你要敲除的基因片段大小差不多？

不是的，，我是拿菌的全基因P的，这肯定不一样大的吧……
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上班族，学习ing……
6楼2010-06-10 13:06:30
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鹏飞九万里

新虫 (初入文坛)
dhmdddd(金币+1): 2010-10-20 08:35:20
lz问题解决了没？我也遇到这样的问题了。。。
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7楼2010-10-19 10:30:45
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kaoyan1230

金虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1):谢谢！ 2010-10-20 08:37:29
具体的比对一下你的基因片段大小和PCR产物的大小是否差不多吧，有的时候大小差别很少的。
也可以在你PCR产物的中间设计一个引物，这样做PCR的话，只有阳性的菌落才能P出来。
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8楼2010-10-19 16:06:27
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kaoyan1230

金虫 (小有名气)
另外，挑取菌落做验证的时候，注意挑取单个菌落
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9楼2010-10-19 16:06:58
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 鹏飞九万里 at 2010-10-19 10:30:45:
lz问题解决了没？我也遇到这样的问题了。。。

没有解决，始终不知道是为什么，我在别的地方看到基因片段转进去基本上是不会表达的，还是疑惑中……
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上班族，学习ing……
10楼2010-10-20 08:36:54
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