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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于基因敲除
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by kaoyan1230 at 2010-10-19 16:06:27:
具体的比对一下你的基因片段大小和PCR产物的大小是否差不多吧，有的时候大小差别很少的。
也可以在你PCR产物的中间设计一个引物，这样做PCR的话，只有阳性的菌落才能P出来。

我插入的片段大概有一千多，加上来的话就应该有三千左右吧，差了一千应该很容易就看的出来吧……设计中间引物也设计了，就是表现出来抗性的菌用中间引物P的时候是乱的，这说明是没有重组上的……很是不理解……
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上班族，学习ing……
11楼2010-10-20 08:46:29
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1): 2010-10-20 16:06:18
有假阳性克隆 有可能你的PCR产物里面混有质粒，不知道你是不是用质粒做模板来P基因的
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好好学习，天天向上
12楼2010-10-20 09:32:28
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 寂寞之巅 at 2010-10-20 09:32:28:
有假阳性克隆 有可能你的PCR产物里面混有质粒，不知道你是不是用质粒做模板来P基因的

我敲除基因最后目的是让抗性基因重组到大肠杆菌上面，最后验证的时候都是那菌落做PCR的……
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上班族，学习ing……
13楼2010-10-20 16:08:17
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1):谢谢，DPN1是什么啊？没有用那个处理过，之前P抗性基因是用质粒P的 2010-10-22 16:51:41
引用回帖:
Originally posted by dhmdddd at 2010-10-20 16:08:17:

我敲除基因最后目的是让抗性基因重组到大肠杆菌上面，最后验证的时候都是那菌落做PCR的……

我是说你在做转化的时候 有没有用DPN1 处理pcr产物 ？有可能里面有质粒，导致平皿上有假阳性克隆。
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好好学习，天天向上
14楼2010-10-21 15:24:00
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shangming

铜虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1):谢谢！ 2010-10-22 16:51:10
有以下几方面的原因：
1)质粒没切好，根本就是未连接上的质粒
2）发生自连接，效果和1)一样的

你可以做一下酶切验证，看看是否可以切出来；
如果不行回头看看设计的引物；
如果都没问题的话这个质粒你们是否以前做出来过，如果没有的话质粒系统可能本身就有问题
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15楼2010-10-22 15:59:06
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
dhmdddd(金币+1):谢谢！ 2010-10-23 10:26:41
会不会是瞬时表达的抗性，你传几代看看。我们这边做真菌的基因敲出的，也是经常遇到这种情况，就是重做。祝你好运。
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16楼2010-10-22 17:14:22
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 寂寞之巅 at 2010-10-21 15:24:00:

我是说你在做转化的时候 有没有用DPN1 处理pcr产物 ？有可能里面有质粒，导致平皿上有假阳性克隆。

DpnI 是一种酶，作用于甲基化位点  去除质粒模板
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dhmdddd
好好学习，天天向上
17楼2010-10-24 10:29:14
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yourboo

禁虫 (初入文坛)
dhmdddd(金币+1): 恩，有可能吧~ 2011-03-11 16:17:32
本帖内容被屏蔽
18楼2011-03-10 22:21:55
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liyutan2006

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+1): 这么牛掰？呵呵 2011-12-24 22:27:29
现在有大肠杆菌基因敲除的试剂盒了啊http://www.ruiyang-biotech.com/_d272408409.htm
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19楼2011-12-21 15:01:19
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davidck

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhmdddd(金币+2): 谢谢~ 2011-12-24 19:18:43
zhang8826857(金币+1): 鼓励交流 2011-12-24 22:27:15
引用回帖:
16楼: Originally posted by linxi8579 at 2010-10-22 17:14:22:
会不会是瞬时表达的抗性，你传几代看看。我们这边做真菌的基因敲出的，也是经常遇到这种情况，就是重做。祝你好运。

这位同学说的挺对的，
另外就是后面一个同学说的，利用DpnI ，把你PCR产物里的模板质粒去掉
这种情况，你不怕麻烦的话就多挑单菌落就ok了，然后菌落PCR验证下就木有问题了
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20楼2011-12-23 11:19:03
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