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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于基因敲除已有5人参与

最近在做大肠基因敲除,转化的是PCR产物,是DNA片段,2000Kb多点,转化后,平板上有菌落长出来,接摇瓶转化子也长,同样的抗生素浓度下转化前的菌株不长,这可以说明转化子表现抗性吧?但是验证PCR时,P出来的条带总是在一条线上,也就是说没有重组上,感觉很奇怪,不知道各位有没有遇到这种情况,这到底是什么原因,转化进去片段应该不会表达的吧?不知道我有没有把问题说清楚,请高手指教!!先谢过了!!
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上班族,学习ing……
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)

dhmdddd(金币+1): 2010-10-20 16:06:18
有假阳性克隆 有可能你的PCR产物里面混有质粒,不知道你是不是用质粒做模板来P基因的
好好学习,天天向上
12楼2010-10-20 09:32:28
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)

dhmdddd(金币+1):谢谢,DPN1是什么啊?没有用那个处理过,之前P抗性基因是用质粒P的 2010-10-22 16:51:41
引用回帖:
Originally posted by dhmdddd at 2010-10-20 16:08:17:

我敲除基因最后目的是让抗性基因重组到大肠杆菌上面,最后验证的时候都是那菌落做PCR的……

我是说你在做转化的时候 有没有用DPN1 处理pcr产物 ?有可能里面有质粒,导致平皿上有假阳性克隆。
好好学习,天天向上
14楼2010-10-21 15:24:00
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 寂寞之巅 at 2010-10-21 15:24:00:

我是说你在做转化的时候 有没有用DPN1 处理pcr产物 ?有可能里面有质粒,导致平皿上有假阳性克隆。

DpnI 是一种酶,作用于甲基化位点  去除质粒模板

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好好学习,天天向上
17楼2010-10-24 10:29:14
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