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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于基因敲除已有5人参与

最近在做大肠基因敲除,转化的是PCR产物,是DNA片段,2000Kb多点,转化后,平板上有菌落长出来,接摇瓶转化子也长,同样的抗生素浓度下转化前的菌株不长,这可以说明转化子表现抗性吧?但是验证PCR时,P出来的条带总是在一条线上,也就是说没有重组上,感觉很奇怪,不知道各位有没有遇到这种情况,这到底是什么原因,转化进去片段应该不会表达的吧?不知道我有没有把问题说清楚,请高手指教!!先谢过了!!
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)

dhmdddd(金币+1):谢谢,DPN1是什么啊?没有用那个处理过,之前P抗性基因是用质粒P的 2010-10-22 16:51:41
引用回帖:
Originally posted by dhmdddd at 2010-10-20 16:08:17:

我敲除基因最后目的是让抗性基因重组到大肠杆菌上面,最后验证的时候都是那菌落做PCR的……

我是说你在做转化的时候 有没有用DPN1 处理pcr产物 ?有可能里面有质粒,导致平皿上有假阳性克隆。
好好学习,天天向上
14楼2010-10-21 15:24:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

也遇到同样的问题啊,做酵母基因敲除,转进了抗性基因,能耐受很高的抗生素浓度,PCR验证却做不出来。
Thank-you,so-blue.
2楼2010-06-10 10:00:08
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临风7071

木虫 (正式写手)

dhmdddd(金币+1):谢谢!酶切试试看! 2010-06-10 12:03:59
做酶切验证,那是最准确的方法。另外,你PCR时应该做阳性对照,以验证是否是PCR的问题
3楼2010-06-10 10:05:44
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 临风7071 at 2010-06-10 10:05:44:
做酶切验证,那是最准确的方法。另外,你PCR时应该做阳性对照,以验证是否是PCR的问题

PCR我做了一个未转化菌株的对照,P出来的条带和转化子P出的条带在在一条带上,我点样时加了一个Marker,结果是全部都没有到2000K,这个应该可以说明PCR没有问题的吧?
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4楼2010-06-10 12:19:46
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