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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 【求助/交流】枯草芽孢杆菌基因敲除~~
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bettyshan

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】枯草芽孢杆菌基因敲除~~

想请教一下做枯草芽孢杆菌的朋友，枯草芽孢杆菌敲除目前有没有无抗敲除的方法呢？那个WB700的菌是利用什么方法获得的，为什么能够敲除那么多的基因？都是用的有抗敲除吗？
如果总是用抗性的话那是不是只能敲除有限的基因啦？~~

谢谢帮我解答啦~~~
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1楼 2011-04-09 11:41:28
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
rainwander(金币+5, EPI+1): 呵呵，不错，给予鼓励 2011-04-09 17:54:09
bettyshan(金币+2): 谢谢给了我这么详细的回答~~~ 2011-04-10 15:32:42
想请教一下做枯草芽孢杆菌的朋友，枯草芽孢杆菌敲除目前有没有无抗敲除的方法呢？（你的无抗是指没有抗生素吗？当然有了，不过你自己详细查查，抗生素其实起到的只是帮助筛选的作用，这样可以简化很多实验步骤）

那个WB700的菌是利用什么方法获得的，（这个由于我做的是P.aeruginosa,你说的这个菌还真是没有见过，不过你可以查阅一下相关的资料，绝对有的！）
为什么能够敲除那么多的基因？（不是为什么能够敲除那么多基因，而是看你做什么用，如果必要的话才会去敲除，如果这个基因和你所研究的课题没有任何关系，试问你会无缘无故去敲除它吗？NO，浪费时间！）
都是用的有抗敲除吗？（敲除基因只是研究基因功能的一个方法，当然了还有别的研究基因的方法，敲除也分很多种，插入突变，缺失突变orRNAi都可以的！）
如果总是用抗性的话那是不是只能敲除有限的基因啦？~~（并不是，只要你想敲除某个基因，载体构建好之后就可以进行敲除。。。。）


ps:我一个一个给你解答！见括号！
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2楼2011-04-09 17:49:20
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★
rainwander(金币+2): 呵呵，估计是没有，鼓励交流~~ 2011-04-10 00:05:39
lz有查过文献吗？

doi:10.1128/AEM.01156-08
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3楼2011-04-09 19:07:06
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流~~~ 2011-04-10 00:05:07
引用回帖:
Originally posted by bettyshan at 2011-04-09 11:41:28:
想请教一下做枯草芽孢杆菌的朋友，枯草芽孢杆菌敲除目前有没有无抗敲除的方法呢？那个WB700的菌是利用什么方法获得的，为什么能够敲除那么多的基因？都是用的有抗敲除吗？
如果总是用抗性的话那是不是只能敲除有 ...

关于敲除有大量的文献报道，要做到反敲除（即抗性基因的敲除）需要合适的质粒，例如温敏型质粒。

可以参考WB600的构建，其实就是在其基础上再敲除了一个蛋白酶，还有WB800也是一样。
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4楼2011-04-09 20:08:45
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serena1205

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
507313楼: Originally posted by 天使托 at 2011-04-09 17:49:20
想请教一下做枯草芽孢杆菌的朋友，枯草芽孢杆菌敲除目前有没有无抗敲除的方法呢？（你的无抗是指没有抗生素吗？当然有了，不过你自己详细查查，抗生素其实起到的只是帮助筛选的作用，这样可以简化很多实验步骤）

...

要是引入了抗性基因又怎么在敲除抗性基因呢
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5楼2013-03-15 22:51:54
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serena1205

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
511428楼: Originally posted by hkfgwww at 2011-04-09 20:08:45
关于敲除有大量的文献报道，要做到反敲除（即抗性基因的敲除）需要合适的质粒，例如温敏型质粒。

可以参考WB600的构建，其实就是在其基础上再敲除了一个蛋白酶，还有WB800也是一样。...

温敏型质粒反敲除原理是什么呢
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6楼2013-03-15 22:53:05
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zhuabachon

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主你看下文献就知道了啊，BGSC上搜ECE195，这个质粒就是无标记敲除枯草芽孢杆菌上的基因的，用的是一个毒性基因进行二次筛选得到，大名鼎鼎的张小舟博士构建的，你可以看下他的文章。还有他的博士论文。
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7楼2014-05-14 00:39:40
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混合配搭

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by 天使托 at 2011-04-09 17:49:20
想请教一下做枯草芽孢杆菌的朋友，枯草芽孢杆菌敲除目前有没有无抗敲除的方法呢？（你的无抗是指没有抗生素吗？当然有了，不过你自己详细查查，抗生素其实起到的只是帮助筛选的作用，这样可以简化很多实验步骤）

...

你好，怎么构建基因敲除载体啊？
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8楼2015-10-26 20:17:05
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)
★
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1. 无痕敲除的方法很多，有基于mazF的方法，有基于温敏型质粒的方法，基于特异性重组位点的Lox-Cre方法或FRT-Flp法，当然还有最近很火热的CRISPR/cas9；仔细查文献，这些方法各有利弊；
2. 枯草的胞外蛋白酶很多，不利于外源蛋白的重组表达，所以要敲除好多个基因；
3. WB700的菌的来源可以去查加拿大学者SUI-LAM WONG教授的文献；
如（1）Engineering a Bacillus subtilis Expression-Secretion System with a Strain Deficient in Six Extracellular Proteases；
4. WB700菌株里面有3个基因是有抗性敲除，4个是无痕敲除；

PS：我所在公司提供芽胞杆菌基因敲除的服务和多种芽孢杆菌的菌株质粒，感兴趣的可以详聊！
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9楼2016-01-21 20:17:44
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zhang-829

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一般情况是利用一个抗性敲除一个基因后，会把这个抗性基因再敲掉。还有一种方法是插入失活，不加入抗性基因。
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10楼2016-03-15 13:36:44
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