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zhougang110

银虫 (小有名气)

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[求助] 地衣芽孢杆菌的基因敲除到底如何做啊？

本人想在地衣芽孢杆菌里敲除一个基因，在新霉素抗性基因两端连接了基因的上下游同源臂，此片段电转入地衣芽孢杆菌的感受态里，可是怎么也长不出来转化子？新霉素筛选平板的浓度为50ppm。哪位虫友做过相关的实验？能否给俺指点一下？谢谢！

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1楼2012-03-05 11:41:22

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iijs

2楼2012-03-05 13:19:09

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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2012-03-05 18:30:17
zhougang110: 金币+5, ★有帮助 2012-04-08 08:33:56

lz用的方法应该叫做one-step inactivation，一步缺失法。我之前做过，是用此方法缺失大肠杆菌中的基因，而且这基因位于质粒上。lz筛不到阳性克隆，可能转化效率低或者同源重组效率低。建议增加同源臂的长度（两端大小应差不多）、优化电转化条件、降低筛选平板上的新霉素浓度，或者干脆用自杀质粒，效率比较高。