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zhougang110

银虫 (小有名气)

[求助] 地衣芽孢杆菌的基因敲除到底如何做啊?

本人想在地衣芽孢杆菌里敲除一个基因,在新霉素抗性基因两端连接了基因的上下游同源臂,此片段电转入地衣芽孢杆菌的感受态里,可是怎么也长不出来转化子?新霉素筛选平板的浓度为50ppm。哪位虫友做过相关的实验?能否给俺指点一下?谢谢!
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking(金币+2): 鼓励积极应助! 2012-03-05 18:30:17
zhougang110: 金币+5, 有帮助 2012-04-08 08:33:56
lz用的方法应该叫做one-step inactivation,一步缺失法。我之前做过,是用此方法缺失大肠杆菌中的基因,而且这基因位于质粒上。lz筛不到阳性克隆,可能转化效率低或者同源重组效率低。建议增加同源臂的长度(两端大小应差不多)、优化电转化条件、降低筛选平板上的新霉素浓度,或者干脆用自杀质粒,效率比较高。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
3楼2012-03-05 13:23:57
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zhougang110

银虫 (小有名气)

还有没有虫友给点建议?
4楼2012-03-06 10:12:21
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liyutan2006

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用过大肠杆菌基因敲除试剂盒,最适合长杆菌,如大肠、枯草。http://www.ruiyang-biotech.com/_d272408409.htm
自己去咨询看看。
5楼2012-04-06 16:15:03
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刘玉佩

金虫 (小有名气)

我们做高等动物细胞的基因敲除,但是原理是一样的,你看敲除的基因是不是致死的?或者同源臂比较短,这种只依靠同源臂来重组的方法效率是相当低的,楼主应该多点耐心!
6楼2013-01-10 16:51:17
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