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chenzhenwei0

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于斑点检测抗体来源，做免疫印迹做不下去了，会不会是一抗出问题了？

我用的二抗是HRP标记的兔抗牛，但是一抗最初说是牛源的，但是后来感觉不太可靠，实验怎么都没有结果。目前通过试剂说明知道一抗可能是牛、兔、羊的，后来想到用DOT实验来检测血清来源以进一步实验，因此有买了二抗兔和羊的（由于一抗不好买其他的），但是经过几次的发现，羊的二抗有显色反应，但是也不很明显, 以下是我的操作方法，请高手指教，谢谢了哈

第一步：将标准阳性血清分别滴于三小块NC膜中央，使充分干燥,蛋白完全粘附与NC膜上，约1h。

第二步：

分别将膜放置于封闭盒中，用20ml含5%脱脂奶粉的PBST封闭1h，倾去封闭液，用PBST对膜稍作漂洗1次30s

第四步：

分别于膜中央滴加二抗辣根辛过氧化物标记的兔抗牛、兔抗羊、羊抗兔40ul, 再用含1%脱脂奶粉的PBST进行孵育1h,孵育二抗后用PBST润洗三次。


第五步：

用小镊子分别将膜从封闭盒取出，置于小平皿中，滴加临时配制的DAB进行显色10min。

是不是操作有问题，感觉结果不理想啊

[ Last edited by 1949stone on 2011-9-6 at 10:41 ]
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1楼 2011-09-06 10:34:16
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chenzhenwei0

铜虫 (小有名气)
怎么没有大侠来回复啊
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2楼2011-09-13 15:19:26
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casey200788

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
chenzhenwei0(金币+1): 2011-12-07 12:09:01
chenzhenwei0(金币+2): ★有帮助 2012-03-07 15:28:34
chenzhenwei0: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-03-16 10:26:38
没有说清楚你的目的啊？你是拿别人的未知来源的一抗来做你的实验？还是就是研知道这个一抗是什么来源的？
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3楼2011-11-24 17:20:42
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chenzhenwei0

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by casey200788 at 2011-11-24 17:20:42:
没有说清楚你的目的啊？你是拿别人的未知来源的一抗来做你的实验？还是就是研知道这个一抗是什么来源的？

是别人的已知一抗
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4楼2012-03-03 17:04:50
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jiaxinfish

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助哦 2012-03-05 11:02:08
chenzhenwei0(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:45:48
chenzhenwei0(金币+2): ★★★很有帮助 2012-03-07 15:28:49
w我看了你的步骤，你的应该是正确的做法，。从你的结果来看，应该是二抗结合一抗的能力很弱，所以造成显色不明显。另外也要考虑是不是显示也有问题，如果是三种不同来源的二抗的话，理论上讲，结合一抗的能力应该是有所区别的，如果三个二抗都很弱的话，也可以换个显色液试试 。不过你的做法还是很好的，很少有学生能想到这么做，赞一个
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5楼2012-03-03 17:45:47
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jiaxinfish

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
chenzhenwei0(金币+3): ★★★很有帮助 2012-03-07 15:28:58
chenzhenwei0: 金币+6, ★★★很有帮助 2012-03-16 10:26:57
另外提一句：
第一步：将标准阳性血清分别滴于三小块NC膜中央，使充分干燥,蛋白完全粘附与NC膜上，约1h

这个应该是指你的一抗吧？？？如果不是那你就做错了，不过我想你应该不会犯这种错误吧
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6楼2012-03-03 17:47:06
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chenzhenwei0

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by jiaxinfish at 2012-03-03 17:47:06:
另外提一句：
第一步：将标准阳性血清分别滴于三小块NC膜中央，使充分干燥,蛋白完全粘附与NC膜上，约1h

这个应该是指你的一抗吧？？？如果不是那你就做错了，不过我想你应该不会犯这种错误吧

嗯 是的 这是买的血清作为一抗 我感觉买的不是很可靠 谢谢你哈
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7楼2012-03-05 10:55:01
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chenzhenwei0

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by jiaxinfish at 2012-03-03 17:45:47:
w我看了你的步骤，你的应该是正确的做法，。从你的结果来看，应该是二抗结合一抗的能力很弱，所以造成显色不明显。另外也要考虑是不是显示也有问题，如果是三种不同来源的二抗的话，理论上讲，结合一抗的能力应该 ...

呵呵 谢谢夸奖 我也有这种感觉 一抗的效价可能不是很好
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8楼2012-03-05 11:00:16
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