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chenzhenwei0

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[求助] 关于斑点检测抗体来源，做免疫印迹做不下去了，会不会是一抗出问题了？

我用的二抗是HRP标记的兔抗牛，但是一抗最初说是牛源的，但是后来感觉不太可靠，实验怎么都没有结果。目前通过试剂说明知道一抗可能是牛、兔、羊的，后来想到用DOT实验来检测血清来源以进一步实验，因此有买了二抗兔和羊的（由于一抗不好买其他的），但是经过几次的发现，羊的二抗有显色反应，但是也不很明显, 以下是我的操作方法，请高手指教，谢谢了哈

第一步：将标准阳性血清分别滴于三小块NC膜中央，使充分干燥,蛋白完全粘附与NC膜上，约1h。

第二步：

分别将膜放置于封闭盒中，用20ml含5%脱脂奶粉的PBST封闭1h，倾去封闭液，用PBST对膜稍作漂洗1次30s

第四步：

分别于膜中央滴加二抗辣根辛过氧化物标记的兔抗牛、兔抗羊、羊抗兔40ul, 再用含1%脱脂奶粉的PBST进行孵育1h,孵育二抗后用PBST润洗三次。

第五步：

用小镊子分别将膜从封闭盒取出，置于小平皿中，滴加临时配制的DAB进行显色10min。

是不是操作有问题，感觉结果不理想啊

[ Last edited by 1949stone on 2011-9-6 at 10:41 ]

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用酶联免疫斑点法检验人HLA2 Ⅰ抗体的新法已经有0人回复

1楼 2011-09-06 10:34:16

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chenzhenwei0

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引用回帖:

楼: Originally posted by jiaxinfish at 2012-03-03 17:47:06:
另外提一句：
第一步：将标准阳性血清分别滴于三小块NC膜中央，使充分干燥,蛋白完全粘附与NC膜上，约1h

这个应该是指你的一抗吧？？？如果不是那你就做错了，不过我想你应该不会犯这种错误吧

嗯是的这是买的血清作为一抗我感觉买的不是很可靠谢谢你哈