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chenzhenwei0铜虫 (小有名气)
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关于斑点检测抗体来源，做免疫印迹做不下去了，会不会是一抗出问题了？
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我用的二抗是HRP标记的兔抗牛，但是一抗最初说是牛源的，但是后来感觉不太可靠，实验怎么都没有结果。目前通过试剂说明知道一抗可能是牛、兔、羊的，后来想到用DOT实验来检测血清来源以进一步实验，因此有买了二抗兔和羊的（由于一抗不好买其他的），但是经过几次的发现，羊的二抗有显色反应，但是也不很明显, 以下是我的操作方法，请高手指教，谢谢了哈 第一步：将标准阳性血清分别滴于三小块NC膜中央，使充分干燥,蛋白完全粘附与NC膜上，约1h。 第二步： 分别将膜放置于封闭盒中，用20ml含5%脱脂奶粉的PBST封闭1h，倾去封闭液，用PBST对膜稍作漂洗1次30s 第四步： 分别于膜中央滴加二抗辣根辛过氧化物标记的兔抗牛、兔抗羊、羊抗兔40ul, 再用含1%脱脂奶粉的PBST进行孵育1h,孵育二抗后用PBST润洗三次。 第五步： 用小镊子分别将膜从封闭盒取出，置于小平皿中，滴加临时配制的DAB进行显色10min。 是不是操作有问题，感觉结果不理想啊 [ Last edited by 1949stone on 2011-9-6 at 10:41 ] |
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4楼2012-03-03 17:04:50
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w我看了你的步骤，你的应该是正确的做法，。从你的结果来看，应该是二抗结合一抗的能力很弱，所以造成显色不明显。另外也要考虑是不是显示也有问题，如果是三种不同来源的二抗的话，理论上讲，结合一抗的能力应该是有所区别的，如果三个二抗都很弱的话，也可以换个显色液试试 。不过你的做法还是很好的，很少有学生能想到这么做，赞一个 |
5楼2012-03-03 17:45:47
6楼2012-03-03 17:47:06
chenzhenwei0
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7楼2012-03-05 10:55:01
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8楼2012-03-05 11:00:16
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