24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

chenzhenwei0

铜虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 232.4
红花: 1
帖子: 54
在线: 31.8小时
虫号: 1169603
注册: 2010-12-14
专业: 兽医免疫学

[求助] 关于斑点检测抗体来源，做免疫印迹做不下去了，会不会是一抗出问题了？

我用的二抗是HRP标记的兔抗牛，但是一抗最初说是牛源的，但是后来感觉不太可靠，实验怎么都没有结果。目前通过试剂说明知道一抗可能是牛、兔、羊的，后来想到用DOT实验来检测血清来源以进一步实验，因此有买了二抗兔和羊的（由于一抗不好买其他的），但是经过几次的发现，羊的二抗有显色反应，但是也不很明显, 以下是我的操作方法，请高手指教，谢谢了哈

第一步：将标准阳性血清分别滴于三小块NC膜中央，使充分干燥,蛋白完全粘附与NC膜上，约1h。

第二步：

分别将膜放置于封闭盒中，用20ml含5%脱脂奶粉的PBST封闭1h，倾去封闭液，用PBST对膜稍作漂洗1次30s

第四步：

分别于膜中央滴加二抗辣根辛过氧化物标记的兔抗牛、兔抗羊、羊抗兔40ul, 再用含1%脱脂奶粉的PBST进行孵育1h,孵育二抗后用PBST润洗三次。

第五步：

用小镊子分别将膜从封闭盒取出，置于小平皿中，滴加临时配制的DAB进行显色10min。

是不是操作有问题，感觉结果不理想啊

[ Last edited by 1949stone on 2011-9-6 at 10:41 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

用酶联免疫斑点法检验人HLA2 Ⅰ抗体的新法已经有0人回复

1楼 2011-09-06 10:34:16

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

jiaxinfish

金虫 (正式写手)

应助: 45 (小学生)
金币: 378.6
帖子: 981
在线: 310小时
虫号: 1308763
注册: 2011-05-28
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助哦 2012-03-05 11:02:08
chenzhenwei0(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:45:48
chenzhenwei0(金币+2): ★★★很有帮助 2012-03-07 15:28:49

w我看了你的步骤，你的应该是正确的做法，。从你的结果来看，应该是二抗结合一抗的能力很弱，所以造成显色不明显。另外也要考虑是不是显示也有问题，如果是三种不同来源的二抗的话，理论上讲，结合一抗的能力应该是有所区别的，如果三个二抗都很弱的话，也可以换个显色液试试。不过你的做法还是很好的，很少有学生能想到这么做，赞一个