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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pMD-18T载体连接出现了问题，请各位高手指点！！！
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
连接没那么多问题，应该是平板的Amp失效所致。
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11楼2010-11-02 17:11:35
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cyz20050505

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我建议你不要继续费心思找原因，能换的东西都换新的，重新来，200bp非常容易克隆，不至于出现这个种情况
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12楼2010-11-06 15:53:13
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tian1203

银虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):鼓励交流！ 2010-11-09 19:08:46
遇到过同样的问题，一般而言200bp应该很好连的。个人建议，重新做感受态，同时做control对照。我上次就是感受态没做好，耽误了很多时间，祝好运！
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别紧张，我不是什么好人...
13楼2010-11-09 10:16:39
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竹林细雨

金虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3):good！ 2010-11-09 19:08:51
1. 找个空质粒转化作阳对照，另一个转水做阴对照。验证感受态效率
2. 我们PCR产物不回收直接连效果也很好，当然回收更好一些。你说回收产物很亮，建议你连接时取1ul就可以，不要太多，因为连接的效率取决于载体和插入片段的碰撞几率，插入片段太多反而阻碍了他们的碰撞。
3. 氨苄平板一般不会失效，我们都有放一年只要不长菌也能用。

如果感受态细胞正常，应该就出在插入片段太多了。多做对照，这个实验应该不难。
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14楼2010-11-09 16:09:45
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raynancy1943

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是胶回收的问题，200bp是小片段，如果没有回收回来的，后面的试验就不好做了，如果跑电泳后发现目的条带很单一，可以不用胶回收，直接连载体就ok了
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15楼2010-11-09 16:27:27
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
氨苄平板上长菌，而且很多
很多是多多啊，连成片了？连成片的话应该是培养基或者抗生素问题。还能区分单菌落就不好说了
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16楼2010-11-09 16:36:21
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方亚楠

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-11-09 19:08:59
我也出现过连不上的情况，后来我试着用蓝白斑筛选，就是除了加氨苄，还加了IPTG和Xgal，这样双重筛选，效果就好多了。我建议你做个，以前转化成功的质粒的阳性对照，如果能生长，说明感受态没问题，要是不能生长，可能就是感受态的问题了。转化不成功，郁闷了好久呢，最近又好了，祝你好运哦。你是要测序吗？如果实在连不上，就用PCR产物测序吧，虽然不如菌液测的准，但是很方便啊，呵呵
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17楼2010-11-09 18:55:30
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韩春歌

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议自己做感受态细胞，我以前做转化也是老不长，自己的感受态细胞就很好。
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18楼2012-10-30 16:09:45
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