【求助/交流】pMD-18T载体连接出现了问题，请各位高手指点！！！ - 分子生物 - 综合其他

11楼2010-11-02 17:11:35

cyz20050505

木虫 (正式写手)

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我建议你不要继续费心思找原因，能换的东西都换新的，重新来，200bp非常容易克隆，不至于出现这个种情况

12楼2010-11-06 15:53:13

tian1203

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遇到过同样的问题，一般而言200bp应该很好连的。个人建议，重新做感受态，同时做control对照。我上次就是感受态没做好，耽误了很多时间，祝好运！

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别紧张，我不是什么好人...

13楼2010-11-09 10:16:39

竹林细雨

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1. 找个空质粒转化作阳对照，另一个转水做阴对照。验证感受态效率
2. 我们PCR产物不回收直接连效果也很好，当然回收更好一些。你说回收产物很亮，建议你连接时取1ul就可以，不要太多，因为连接的效率取决于载体和插入片段的碰撞几率，插入片段太多反而阻碍了他们的碰撞。
3. 氨苄平板一般不会失效，我们都有放一年只要不长菌也能用。

如果感受态细胞正常，应该就出在插入片段太多了。多做对照，这个实验应该不难。

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14楼2010-11-09 16:09:45

raynancy1943

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是不是胶回收的问题，200bp是小片段，如果没有回收回来的，后面的试验就不好做了，如果跑电泳后发现目的条带很单一，可以不用胶回收，直接连载体就ok了

15楼2010-11-09 16:27:27

gongeleven

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氨苄平板上长菌，而且很多
很多是多多啊，连成片了？连成片的话应该是培养基或者抗生素问题。还能区分单菌落就不好说了

16楼2010-11-09 16:36:21

方亚楠

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我也出现过连不上的情况，后来我试着用蓝白斑筛选，就是除了加氨苄，还加了IPTG和Xgal，这样双重筛选，效果就好多了。我建议你做个，以前转化成功的质粒的阳性对照，如果能生长，说明感受态没问题，要是不能生长，可能就是感受态的问题了。转化不成功，郁闷了好久呢，最近又好了，祝你好运哦。你是要测序吗？如果实在连不上，就用PCR产物测序吧，虽然不如菌液测的准，但是很方便啊，呵呵

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17楼2010-11-09 18:55:30

韩春歌

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建议自己做感受态细胞，我以前做转化也是老不长，自己的感受态细胞就很好。

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18楼2012-10-30 16:09:45