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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段连接问题
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

[求助] 大片段连接问题

实验室得到一个片段为2300bp左右的DNA序列，但是连接了半个月都没有连上，连接体系是：19T 0.5ul
            目的条带 5ul
           solution I  5ul
       过夜4度，16度连接3h
   也做过16度连接两夜
    做过4度
  期间确定目的条带回收正确，连接体系也用了最新的，感受态是买的，在这个条带的靠近3‘端约200bp是已知的，根据这个片段设计引物，扩增约为140bp。
  得到的结果：1.不长菌
              2.长菌，但是扩增无条带
              3.长菌，扩增出140bp,但是测序后，结果告知插入片段只有200bp,且这200bp片段就是已知部分，抽了质粒后得知条带大约就是比2000bp的大点。

我快疯了，折腾了半个月，序列还没得到，求高人指导！
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1楼 2012-04-14 20:04:35
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yyy_zzz at 2012-04-16 09:13:10:
看你的意思，你想要片段的序列？那就直接把片段送去测序好了，引物从你已知的部分设计。等测序结果出来了，一切就好办了。其实，T载的连接效率并不是固定的，有时候同样大的片段，有的很好连接，有的就很难连接。

主要是我的实验，上游是试剂盒的接头，下游是我设计的引物，一般把片段送出去，要提供一对引物的。我只能提供下游引物
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11楼2012-04-16 12:08:21
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lwq652 at 2012-04-16 10:27:07:
其实2k不算什么大片段的，我们单个基因就有2k多，几个基因下来更长。我们一般的体系是10ul，酶0.5，buffer 1，基因加载体8.5，至于两者比例要看电泳条带，但载体不超过3ul。连接十分钟到半个小时（说明书是十分钟 ...

请问你们是用的什么连接试剂盒？
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12楼2012-04-16 12:08:56
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by zx6291 at 2012-04-16 14:08:26:
从结果看是没有连上啊，确认PCR目的条带是否已加A尾啊？

使用LA Taq酶，所以片段的3端是加了A的
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19楼2012-04-18 12:51:49
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