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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by yyy_zzz at 2012-04-16 09:13:10:
看你的意思,你想要片段的序列?那就直接把片段送去测序好了,引物从你已知的部分设计。等测序结果出来了,一切就好办了。其实,T载的连接效率并不是固定的,有时候同样大的片段,有的很好连接,有的就很难连接。

主要是我的实验,上游是试剂盒的接头,下游是我设计的引物,一般把片段送出去,要提供一对引物的。我只能提供下游引物
11楼2012-04-16 12:08:21
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by lwq652 at 2012-04-16 10:27:07:
其实2k不算什么大片段的,我们单个基因就有2k多,几个基因下来更长。我们一般的体系是10ul,酶0.5,buffer 1,基因加载体8.5,至于两者比例要看电泳条带,但载体不超过3ul。连接十分钟到半个小时(说明书是十分钟 ...

请问你们是用的什么连接试剂盒?
12楼2012-04-16 12:08:56
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lwq652

木虫 (正式写手)

厄,我错了,你是做ta克隆的。我以为你做的是普通的酶切连接克隆。TA克隆我们偶尔做,用的是invitrogen的一个试剂盒,但是没用配套的酶,用的是fermentas的连接酶,主要是他速度快。不过就做过几次,最长的一段也就1.8k
一念错,便觉百行皆非,防之当如渡海浮囊,勿容一针之罅漏
13楼2012-04-16 12:46:38
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从结果看是没有连上啊,确认PCR目的条带是否已加A尾啊?
14楼2012-04-16 14:08:26
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-17 13:43:14
xiazhiwuxie: 金币+1, 有帮助, 我送出去了,试试看 2012-04-22 10:56:43
曾经用过全式金的T载体,连接效果非常好!25℃,你的片段连接20min即可,载体是双抗性,不用蓝白斑筛选。转化涂板amp或者kan,挑单斑到kan或者amp的LB中,能摇起来的都是阳性。
15楼2012-04-16 14:29:03
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-04-16 12:08:21:
主要是我的实验,上游是试剂盒的接头,下游是我设计的引物,一般把片段送出去,要提供一对引物的。我只能提供下游引物

片段测序可以只提供一个引物,单向进行测序,有下游引物就够了
16楼2012-04-16 19:16:50
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-17 13:43:35
本帖内容被屏蔽

17楼2012-04-16 20:40:25
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adloves

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-17 13:43:48
我最近一周做了2700bp片段的连接,所用的载体和你一样的,很顺利,直接连接上了。我加的体系是 19T 1ul , 目的条带 4ul, solution I  5ul。片段浓度也不高,做的是胶回收;感觉还好吧。
杜钰~
18楼2012-04-17 10:48:31
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by zx6291 at 2012-04-16 14:08:26:
从结果看是没有连上啊,确认PCR目的条带是否已加A尾啊?

使用LA Taq酶,所以片段的3端是加了A的
19楼2012-04-18 12:51:49
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方杜若

新虫 (初入文坛)

我目前也碰到了类似问题
20楼2013-04-03 21:43:34
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