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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段连接问题
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yyy_zzz at 2012-04-16 09:13:10:
看你的意思，你想要片段的序列？那就直接把片段送去测序好了，引物从你已知的部分设计。等测序结果出来了，一切就好办了。其实，T载的连接效率并不是固定的，有时候同样大的片段，有的很好连接，有的就很难连接。

主要是我的实验，上游是试剂盒的接头，下游是我设计的引物，一般把片段送出去，要提供一对引物的。我只能提供下游引物
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11楼2012-04-16 12:08:21
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lwq652 at 2012-04-16 10:27:07:
其实2k不算什么大片段的，我们单个基因就有2k多，几个基因下来更长。我们一般的体系是10ul，酶0.5，buffer 1，基因加载体8.5，至于两者比例要看电泳条带，但载体不超过3ul。连接十分钟到半个小时（说明书是十分钟 ...

请问你们是用的什么连接试剂盒？
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12楼2012-04-16 12:08:56
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lwq652

木虫 (正式写手)
厄，我错了，你是做ta克隆的。我以为你做的是普通的酶切连接克隆。TA克隆我们偶尔做，用的是invitrogen的一个试剂盒，但是没用配套的酶，用的是fermentas的连接酶，主要是他速度快。不过就做过几次，最长的一段也就1.8k
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一念错，便觉百行皆非，防之当如渡海浮囊，勿容一针之罅漏
13楼2012-04-16 12:46:38
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从结果看是没有连上啊，确认PCR目的条带是否已加A尾啊？
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14楼2012-04-16 14:08:26
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-17 13:43:14
xiazhiwuxie: 金币+1, ★有帮助, 我送出去了，试试看 2012-04-22 10:56:43
曾经用过全式金的T载体，连接效果非常好！25℃，你的片段连接20min即可，载体是双抗性，不用蓝白斑筛选。转化涂板amp或者kan，挑单斑到kan或者amp的LB中，能摇起来的都是阳性。
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15楼2012-04-16 14:29:03
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-04-16 12:08:21:
主要是我的实验，上游是试剂盒的接头，下游是我设计的引物，一般把片段送出去，要提供一对引物的。我只能提供下游引物

片段测序可以只提供一个引物，单向进行测序，有下游引物就够了
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16楼2012-04-16 19:16:50
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-17 13:43:35
本帖内容被屏蔽
17楼2012-04-16 20:40:25
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adloves

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-17 13:43:48
我最近一周做了2700bp片段的连接，所用的载体和你一样的，很顺利，直接连接上了。我加的体系是 19T 1ul ， 目的条带 4ul， solution I  5ul。片段浓度也不高，做的是胶回收；感觉还好吧。
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杜钰~
18楼2012-04-17 10:48:31
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by zx6291 at 2012-04-16 14:08:26:
从结果看是没有连上啊，确认PCR目的条带是否已加A尾啊？

使用LA Taq酶，所以片段的3端是加了A的
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19楼2012-04-18 12:51:49
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方杜若

新虫 (初入文坛)
我目前也碰到了类似问题
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20楼2013-04-03 21:43:34
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