| 查看: 3430 | 回复: 20 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
xiazhiwuxie银虫 (小有名气)
|
[求助]
大片段连接问题
|
|
|
实验室得到一个片段为2300bp左右的DNA序列，但是连接了半个月都没有连上，连接体系是：19T 0.5ul 目的条带 5ul solution I 5ul 过夜4度，16度连接3h 也做过16度连接两夜 做过4度 期间确定目的条带回收正确，连接体系也用了最新的，感受态是买的，在这个条带的靠近3‘端约200bp是已知的，根据这个片段设计引物，扩增约为140bp。 得到的结果：1.不长菌 2.长菌，但是扩增无条带 3.长菌，扩增出140bp,但是测序后，结果告知插入片段只有200bp,且这200bp片段就是已知部分，抽了质粒后得知条带大约就是比2000bp的大点。 我快疯了，折腾了半个月，序列还没得到，求高人指导！ |
回复此楼» 猜你喜欢
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有174人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
化工申博
已经有3人回复
-
申博自荐
已经有3人回复
-
广西民族大学化学化工学院化学工程与技术学硕，材料化工专硕调剂名额充足！
已经有0人回复
15楼2012-04-16 14:29:03
dingfang0707
金虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 1570.1
- 散金: 499
- 红花: 2
- 帖子: 507
- 在线: 208.3小时
- 虫号: 1177271
- 注册: 2010-12-25
- 性别: MM
- 专业: 细胞增殖、生长与分化
2楼2012-04-14 20:20:10
ghs25372216
禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+5, ★有帮助, 我昨天想用T4连接酶连着，但是实验室没人做过，今天试试 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金币+3, 恩，可以试下 2012-04-16 13:54:47
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+5, ★有帮助, 我昨天想用T4连接酶连着，但是实验室没人做过，今天试试 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金币+3, 恩，可以试下 2012-04-16 13:54:47
|
本帖内容被屏蔽 |
3楼2012-04-15 09:46:42
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, PCR回收后条带清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金币+3, 鼓励正解解答问题 2012-04-16 13:55:10
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, PCR回收后条带清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金币+3, 鼓励正解解答问题 2012-04-16 13:55:10
|
1.连接体系为10uL，目的DNA片段应为4.5uL,一般试剂盒都可用，连接温度是不关键因素，时间过夜即可。 2.一定要保证PCR要达到一定浓度和纯度才可以，这一点至关重要。 3.另外，楼主说的300bp引物是菌液PCR检测引物吗？最好用一个载体引物，一个片段上的引物，假阳性会降低，而且最好把全长扩出来。 4.若果菌液ＰＣＲ扩出来了就不用提质粒了酶切了，可以直接测序。 |
4楼2012-04-15 12:16:44
50