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xiazhiwuxie银虫 (小有名气)
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[求助]
大片段连接问题
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实验室得到一个片段为2300bp左右的DNA序列，但是连接了半个月都没有连上，连接体系是：19T 0.5ul 目的条带 5ul solution I 5ul 过夜4度，16度连接3h 也做过16度连接两夜 做过4度 期间确定目的条带回收正确，连接体系也用了最新的，感受态是买的，在这个条带的靠近3‘端约200bp是已知的，根据这个片段设计引物，扩增约为140bp。 得到的结果：1.不长菌 2.长菌，但是扩增无条带 3.长菌，扩增出140bp,但是测序后，结果告知插入片段只有200bp,且这200bp片段就是已知部分，抽了质粒后得知条带大约就是比2000bp的大点。 我快疯了，折腾了半个月，序列还没得到，求高人指导！ |
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 分子生化实验经验积累 |
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10楼2012-04-16 10:51:02
dingfang0707
金虫 (正式写手)
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2楼2012-04-14 20:20:10
ghs25372216
禁虫 (正式写手)
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感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+5, ★有帮助, 我昨天想用T4连接酶连着，但是实验室没人做过，今天试试 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金币+3, 恩，可以试下 2012-04-16 13:54:47
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3楼2012-04-15 09:46:42
【答案】应助回帖
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xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, PCR回收后条带清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金币+3, 鼓励正解解答问题 2012-04-16 13:55:10
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xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, PCR回收后条带清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金币+3, 鼓励正解解答问题 2012-04-16 13:55:10
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1.连接体系为10uL，目的DNA片段应为4.5uL,一般试剂盒都可用，连接温度是不关键因素，时间过夜即可。 2.一定要保证PCR要达到一定浓度和纯度才可以，这一点至关重要。 3.另外，楼主说的300bp引物是菌液PCR检测引物吗？最好用一个载体引物，一个片段上的引物，假阳性会降低，而且最好把全长扩出来。 4.若果菌液ＰＣＲ扩出来了就不用提质粒了酶切了，可以直接测序。 |
4楼2012-04-15 12:16:44
