| 查看: 2983 | 回复: 20 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
xiazhiwuxie银虫 (小有名气)
|
[求助]
大片段连接问题
|
||
|
实验室得到一个片段为2300bp左右的DNA序列，但是连接了半个月都没有连上，连接体系是：19T 0.5ul 目的条带 5ul solution I 5ul 过夜4度，16度连接3h 也做过16度连接两夜 做过4度 期间确定目的条带回收正确，连接体系也用了最新的，感受态是买的，在这个条带的靠近3‘端约200bp是已知的，根据这个片段设计引物，扩增约为140bp。 得到的结果：1.不长菌 2.长菌，但是扩增无条带 3.长菌，扩增出140bp,但是测序后，结果告知插入片段只有200bp,且这200bp片段就是已知部分，抽了质粒后得知条带大约就是比2000bp的大点。 我快疯了，折腾了半个月，序列还没得到，求高人指导！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 |
» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有133人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
已经有54人回复- BAC文库连接转化
已经有22人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- 连接体系的确定
已经有19人回复
- 载体连接
已经有7人回复
- 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
已经有24人回复
- 【求助/交流】连接几次，仍然不见菌落出现
已经有15人回复
- 【求助/交流】pMD-18T载体连接出现了问题，请各位高手指点！！！
已经有17人回复
- 【求助/交流】超大片段连接问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】4kb片段的连接
已经有14人回复
- 【求助/交流】大片段连接转化成功与否问题
已经有11人回复
- 【求助/交流】长片段的连接转化
已经有9人回复
- 【求助/交流】关于PCR克隆片段连接问题
已经有4人回复
9楼2012-04-16 10:27:07
dingfang0707
金虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 1570.1
- 散金: 499
- 红花: 2
- 帖子: 507
- 在线: 208.3小时
- 虫号: 1177271
- 注册: 2010-12-25
- 性别: MM
- 专业: 细胞增殖、生长与分化
2楼2012-04-14 20:20:10
ghs25372216
禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+5, ★有帮助, 我昨天想用T4连接酶连着，但是实验室没人做过，今天试试 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金币+3, 恩，可以试下 2012-04-16 13:54:47
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+5, ★有帮助, 我昨天想用T4连接酶连着，但是实验室没人做过，今天试试 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金币+3, 恩，可以试下 2012-04-16 13:54:47
|
本帖内容被屏蔽 |
3楼2012-04-15 09:46:42
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, PCR回收后条带清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金币+3, 鼓励正解解答问题 2012-04-16 13:55:10
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, PCR回收后条带清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金币+3, 鼓励正解解答问题 2012-04-16 13:55:10
|
1.连接体系为10uL，目的DNA片段应为4.5uL,一般试剂盒都可用，连接温度是不关键因素，时间过夜即可。 2.一定要保证PCR要达到一定浓度和纯度才可以，这一点至关重要。 3.另外，楼主说的300bp引物是菌液PCR检测引物吗？最好用一个载体引物，一个片段上的引物，假阳性会降低，而且最好把全长扩出来。 4.若果菌液ＰＣＲ扩出来了就不用提质粒了酶切了，可以直接测序。 |
4楼2012-04-15 12:16:44