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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-12-06 20:08:34
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励 2012-12-06 20:08:42

楼主的第一个克隆难度的确是蛮大的，第二个还好，
1. 根据你的描述，总是空板，你有没有测试过你转化时用的感受态的效率，因为你是多片段和大片段连接，对感受态效率还是有一定要求的，最好用那种超级感受态细胞转化比较好，因此，你首先测试下你的感受态细胞，同时用个阳性质粒测试你的平板的抗性，你天天收白板，也可能是你用错抗性平板了

2. 对于第一个多片段克隆，片段是不是太多了点，而且你是PCR产物直接酶切，你可以先把片段连上T-载体等中间载体，然后再酶切回收回来，这样保证每一个片段都被充分酶切开，然后再多片段连试试

3.对于第一个多片段连接，楼主是不是也可考虑用Overlap PCR的方法，先把四个片段拼接为一个片段再往载体上连

4. 你大片段连接的过程和体系都是没有问题的，但是你总是连接不上，会不会是所用连接酶有问题？

5. 不知道楼主大片段连接是，载体单酶切后有没有进行去磷酸化，如果没有的话，连接后，板子上应该会长很多克隆才对，这是载体自连导致的，是板子的问题还是感受态的问题，楼主可以排查一下

[ Last edited by gyesang on 2012-12-19 at 23:57 ]