应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 易错PCR酶切与连接
241/3返回列表123下一页
查看: 2895  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

neer

铁虫 (初入文坛)

[求助] 易错PCR酶切与连接 已有8人参与

做了大半年的易错PCR，但酶切连接后转化子很少，求助！！！
我的基因为2700bp，质粒为pET-28（a），酶切位点为BamH I与Xhol，FD、NEB的内切酶都试过，效果都不好，请各位大侠赐教。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-10-30 16:29:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-31 13:23:22
首尾两端多加几个保护碱基试试。。
赞一下 回复此楼
学习再学习，努力再努力。
2楼2014-10-31 10:42:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-31 13:23:31
突变的起始区域选在你的酶切位点的前后100bp。
赞一下 回复此楼
3楼2014-10-31 10:55:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

厚德求是

木虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-10-31 23:12:39
你说的转化子少，不是没有，所以我想是不是感受态的问题啊，重制感受态试试看，用商品化的感受态制备试剂盒，自己做的毕竟难保证好还是不好。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
4楼2014-10-31 13:45:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-31 10:42:34
首尾两端多加几个保护碱基试试。。

BamH I保护碱基为3个，Xhol保护碱基为6个，感受态是买的。转化子能有几十个，但阳性很少，几乎没有，如果质粒酶切时去磷酸化后转化子就很少了。
赞一下 回复此楼
5楼2014-10-31 14:43:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-10-31 10:55:54
突变的起始区域选在你的酶切位点的前后100bp。

如何选择？我的引物为：目的片段的20几个碱基+酶切位点+保护碱基。
赞一下 回复此楼
6楼2014-10-31 14:46:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-31 10:42:34
首尾两端多加几个保护碱基试试。。

BamH I为3个保护碱基，Xhol为6个保护碱基。
赞一下 回复此楼
7楼2014-10-31 14:47:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huangrui1988

铜虫 (小有名气)
★ ★
neer(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-01 19:26:14
引用回帖:
6楼: Originally posted by neer at 2014-10-31 14:46:03
如何选择？我的引物为：目的片段的20几个碱基+酶切位点+保护碱基。...

你把你的突变片扩大不就可以了吗。 你首先构建一个野生型的基因在质粒上面的，然后往这个基因的上下游各自100bp设计引物就可以了。这样的话，你扩出来的片段就会使前面100bp+你的基因片段+后面100bp，经过酶切就可以得到你要的基因片段了。这样做的好处就是你可以避免酶切位点的突变错误，易错PCR一开始的位点很奇葩，经常会出现酶切失败的情况。
赞一下 回复此楼
8楼2014-10-31 23:47:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-10-31 23:47:22
你把你的突变片扩大不就可以了吗。 你首先构建一个野生型的基因在质粒上面的，然后往这个基因的上下游各自100bp设计引物就可以了。这样的话，你扩出来的片段就会使前面100bp+你的基因片段+后面100bp，经过酶切就可 ...

是不是就是前面100bp+BamHI+基因片段+Xhol+后面100bp？
这样的话，会不会将酶切位点突变了？
有点笨，希望耐心赐教
赞一下 回复此楼
9楼2014-11-01 18:29:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huangrui1988

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by neer at 2014-11-01 18:29:49
是不是就是前面100bp+BamHI+基因片段+Xhol+后面100bp？
这样的话，会不会将酶切位点突变了？
有点笨，希望耐心赐教...

是的，酶切位点突变概率明显比你低。另外你需要经过酶切之后胶回收的，大小变化正确的，你才回收，这样还错，那就天意啊。
赞一下 回复此楼
10楼2014-11-01 23:33:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 neer 的主题更新
241/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 科研孤儿太难了 +9 我4大白菜 2026-08-20 9/450 2026-08-20 18:23 by 2549091707
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +21 yaoyewhu2008 2026-08-20 22/1100 2026-08-20 17:03 by yaoyewhu2008
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +9 zju2000 2026-08-16 10/500 2026-08-20 15:56 by Leogzhya
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+3 snowwithsea 2026-08-19 12/600 2026-08-20 15:56 by lfy8008
[基金申请] 言之凿凿，明天官网会通知放榜？ +14 医学老男孩 2026-08-20 16/800 2026-08-20 15:47 by LNP@mRNA
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +16 Ldrop2023 2026-08-13 20/1000 2026-08-20 11:07 by xskun
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +14 kkkl_v 2026-08-19 15/750 2026-08-20 08:21 by sunzitan
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭