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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 易错PCR酶切与连接
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neer

铁虫 (初入文坛)

[求助] 易错PCR酶切与连接 已有8人参与

做了大半年的易错PCR，但酶切连接后转化子很少，求助！！！
我的基因为2700bp，质粒为pET-28（a），酶切位点为BamH I与Xhol，FD、NEB的内切酶都试过，效果都不好，请各位大侠赐教。
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1楼 2014-10-30 16:29:15
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-31 13:23:22
首尾两端多加几个保护碱基试试。。
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学习再学习，努力再努力。
2楼2014-10-31 10:42:34
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-31 13:23:31
突变的起始区域选在你的酶切位点的前后100bp。
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3楼2014-10-31 10:55:54
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厚德求是

木虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-10-31 23:12:39
你说的转化子少，不是没有，所以我想是不是感受态的问题啊，重制感受态试试看，用商品化的感受态制备试剂盒，自己做的毕竟难保证好还是不好。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-10-31 13:45:33
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neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-31 10:42:34
首尾两端多加几个保护碱基试试。。

BamH I保护碱基为3个，Xhol保护碱基为6个，感受态是买的。转化子能有几十个，但阳性很少，几乎没有，如果质粒酶切时去磷酸化后转化子就很少了。
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5楼2014-10-31 14:43:44
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neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-10-31 10:55:54
突变的起始区域选在你的酶切位点的前后100bp。

如何选择？我的引物为：目的片段的20几个碱基+酶切位点+保护碱基。
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6楼2014-10-31 14:46:03
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neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-31 10:42:34
首尾两端多加几个保护碱基试试。。

BamH I为3个保护碱基，Xhol为6个保护碱基。
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7楼2014-10-31 14:47:34
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)
★ ★
neer(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-01 19:26:14
引用回帖:
6楼: Originally posted by neer at 2014-10-31 14:46:03
如何选择？我的引物为：目的片段的20几个碱基+酶切位点+保护碱基。...

你把你的突变片扩大不就可以了吗。 你首先构建一个野生型的基因在质粒上面的，然后往这个基因的上下游各自100bp设计引物就可以了。这样的话，你扩出来的片段就会使前面100bp+你的基因片段+后面100bp，经过酶切就可以得到你要的基因片段了。这样做的好处就是你可以避免酶切位点的突变错误，易错PCR一开始的位点很奇葩，经常会出现酶切失败的情况。
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8楼2014-10-31 23:47:22
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neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-10-31 23:47:22
你把你的突变片扩大不就可以了吗。 你首先构建一个野生型的基因在质粒上面的，然后往这个基因的上下游各自100bp设计引物就可以了。这样的话，你扩出来的片段就会使前面100bp+你的基因片段+后面100bp，经过酶切就可 ...

是不是就是前面100bp+BamHI+基因片段+Xhol+后面100bp？
这样的话，会不会将酶切位点突变了？
有点笨，希望耐心赐教
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9楼2014-11-01 18:29:49
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by neer at 2014-11-01 18:29:49
是不是就是前面100bp+BamHI+基因片段+Xhol+后面100bp？
这样的话，会不会将酶切位点突变了？
有点笨，希望耐心赐教...

是的，酶切位点突变概率明显比你低。另外你需要经过酶切之后胶回收的，大小变化正确的，你才回收，这样还错，那就天意啊。
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10楼2014-11-01 23:33:59
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