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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 易错PCR酶切与连接
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neer

铁虫 (初入文坛)

[求助] 易错PCR酶切与连接已有8人参与

做了大半年的易错PCR，但酶切连接后转化子很少，求助！！！
我的基因为2700bp，质粒为pET-28（a），酶切位点为BamH I与Xhol，FD、NEB的内切酶都试过，效果都不好，请各位大侠赐教。
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1楼2014-10-30 16:29:15
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neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-31 10:42:34
首尾两端多加几个保护碱基试试。。

BamH I保护碱基为3个，Xhol保护碱基为6个，感受态是买的。转化子能有几十个，但阳性很少，几乎没有，如果质粒酶切时去磷酸化后转化子就很少了。
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5楼2014-10-31 14:43:44
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neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-10-31 10:55:54
突变的起始区域选在你的酶切位点的前后100bp。

如何选择？我的引物为：目的片段的20几个碱基+酶切位点+保护碱基。
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6楼2014-10-31 14:46:03
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neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-31 10:42:34
首尾两端多加几个保护碱基试试。。

BamH I为3个保护碱基，Xhol为6个保护碱基。
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7楼2014-10-31 14:47:34
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neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-10-31 23:47:22
你把你的突变片扩大不就可以了吗。 你首先构建一个野生型的基因在质粒上面的，然后往这个基因的上下游各自100bp设计引物就可以了。这样的话，你扩出来的片段就会使前面100bp+你的基因片段+后面100bp，经过酶切就可 ...

是不是就是前面100bp+BamHI+基因片段+Xhol+后面100bp？
这样的话，会不会将酶切位点突变了？
有点笨，希望耐心赐教
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9楼2014-11-01 18:29:49
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neer

铁虫 (初入文坛)
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13楼: Originally posted by caihang at 2014-11-02 16:03:09
必须要批评你，做了大半年连接，感觉你连问题的关键都没找到。
1，你确定是酶切效果不好吗？你用这两种酶分别单酶切，然后用单酶切回收的质粒做转化，看有没有长菌，有就是酶切不行。
2，xho 1这个酶切位点你查过 ...

我也很着急。我已经请教了老师和同学，他们也都不知道问题出在哪。
1、质粒单切我都做过，是可以切开质粒的，这点是验证过的。
2、BamHI和Xhol这两种酶，FD和NEB的牌子我都试过，效果还是不好。NEB的技术支持说这两种酶是很常用的酶，应该不会有问题。
3、Solution 1我也试过，用的TAKARA连接试剂盒，阳性转化子也很少。
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15楼2014-11-03 09:40:48
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