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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物纯化后酶切，连接
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lishaohe

新虫 (小有名气)

[交流] PCR产物纯化后酶切，连接

最近需要通过PCR产物，酶切，连接转化B L21建菌库，但是PCR产物酶切，连接转化效率很低，请问各位大虾，有没有更好的办法。引物加了保护碱基。或者更好的建库方案，谢谢！
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peakg7

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1楼 2013-03-02 15:21:51
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lishaohe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by peakg7 at 2013-03-02 16:15:41
酶切效率不高，连接酶的问题？...

连接酶应该没有问题，估计是PCR片段酶切效率太低，大部分片段都没有切开。也没有办法检测。
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5楼2013-03-02 20:34:54
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zltj2008

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
试剂盒回收的片段，杂质很多，很影响后续的连接效率。所以我也建议不回收，直接“酒精+醋酸钠沉降”后做酶切，你甚至也可以直接在PCR反应后的体系里直接加内切酶和BSA，不过这种办法不够严谨，构个普通的载体可以，要是建库那就算了。
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lishaohe
21楼2013-03-06 11:12:30
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普通回帖

peakg7

新虫 (小有名气)
★
lishaohe(金币+3): 谢谢参与
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pcr产物直接回收，不要跑胶回收，效率会提高很多倍。
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2楼2013-03-02 15:30:00
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lishaohe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by peakg7 at 2013-03-02 15:30:00
pcr产物直接回收，不要跑胶回收，效率会提高很多倍。

我们就是直接回收的，片段很亮。直接用的就是PCR产物回收试剂盒
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3楼2013-03-02 15:40:08
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peakg7

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lishaohe at 2013-03-02 15:40:08
我们就是直接回收的，片段很亮。直接用的就是PCR产物回收试剂盒...

酶切效率不高，连接酶的问题？
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4楼2013-03-02 16:15:41
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酶切专家

金虫 (小有名气)
★
lishaohe(金币+3): 谢谢参与
请参见我对今天“ApaI酶切位点保护碱基”帖子的回复，希望有帮助。
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6楼2013-03-02 22:36:39
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sc5921041

木虫 (著名写手)
★
lishaohe(金币+3): 谢谢参与
  I encountered the same problem recently
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8楼2013-03-03 00:53:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不同的酶切割末端的位点时的效率是不同的，即使加了保护碱基提高切割效率，通常还是会比切中间的时候效率低。不知道你用的哪两个酶，一般是根据效率延长切割时间或者适当增加酶的用量。
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9楼2013-03-03 01:42:59
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lishaohe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-03 01:42:59
不同的酶切割末端的位点时的效率是不同的，即使加了保护碱基提高切割效率，通常还是会比切中间的时候效率低。不知道你用的哪两个酶，一般是根据效率延长切割时间或者适当增加酶的用量。

XhoI和NdeI
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10楼2013-03-03 09:21:58
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by sc5921041 at 2013-03-03 00:53:10
  I encountered the same problem recently

能不说英语吗？你能看懂汉语就不能说汉语！
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11楼2013-03-03 14:24:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by lishaohe at 2013-03-03 09:21:58
XhoI和NdeI...

这两个酶切末端的效率都不高，最好切过夜。不过切载体的时候NdeI切长了容易切过，最好按时间切。
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12楼2013-03-04 05:09:38
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lishaohe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-04 05:09:38
这两个酶切末端的效率都不高，最好切过夜。不过切载体的时候NdeI切长了容易切过，最好按时间切。...

嗯，谢谢！
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13楼2013-03-04 20:40:00
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dayulee

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还有酶的活性，是哪个公司的呢？你的产物是不是经过纯化过或其他成分影响了酶活？另外，还有连接的时候你的流程是什么，具体描述下呗
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lishaohe
14楼2013-03-05 08:07:29
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fanfenggui

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
那种回收都有损失的。我们都酒精+醋酸钠沉降后晾干溶解过夜切就OK了！
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lishaohe
15楼2013-03-05 10:22:17
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小love肖

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
NdeI你加了多少个保护碱基啊？一般要加7个，而且至少酶切过夜才能切开，估计你没有完全切开吧
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16楼2013-03-05 14:29:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果切不开，楼主可以将PCR片段先构建在克隆载体上比如T载体，抽质粒再酶切回收你的片段，构建到目标载体上
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17楼2013-03-05 18:57:58
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lishaohe

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by dayulee at 2013-03-05 08:07:29
还有酶的活性，是哪个公司的呢？你的产物是不是经过纯化过或其他成分影响了酶活？另外，还有连接的时候你的流程是什么，具体描述下呗

产物都是经过胶回收（试剂盒），然后做的双酶切，酶切是37°，一般切3-4h。然后连接，我们实验室一般采用的是25°，T4连接酶连接3-4h，也16°连接过夜过。效果都不怎么好。酶肯定是没有问题的，切PUC质粒就很好。
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18楼2013-03-05 22:47:26
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lishaohe

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by fanfenggui at 2013-03-05 10:22:17
那种回收都有损失的。我们都酒精+醋酸钠沉降后晾干溶解过夜切就OK了！

嗯，谢谢！我们回收(酶切)后跑过电泳检测。都确定回收过来片度了
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19楼2013-03-05 22:48:43
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lishaohe

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-05 18:57:58
如果切不开，楼主可以将PCR片段先构建在克隆载体上比如T载体，抽质粒再酶切回收你的片段，构建到目标载体上

我们要构建库，不能连接T载体，要不然后续全部把克隆都提质粒，再连接，转化到表达菌株中，就很麻烦。
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20楼2013-03-05 22:50:20
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zqb2010

铁虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
18楼: Originally posted by lishaohe at 2013-03-05 22:47:26
产物都是经过胶回收（试剂盒），然后做的双酶切，酶切是37°，一般切3-4h。然后连接，我们实验室一般采用的是25°，T4连接酶连接3-4h，也16°连接过夜过。效果都不怎么好。酶肯定是没有问题的，切PUC质粒就很好。...

这两个酶，我们一般切过夜，37度，59微升体系加1微升酶，酶是NEB的，连接的话是3个小时连，结果挺好的。
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22楼2013-03-06 13:37:00
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lishaohe

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
21楼: Originally posted by zltj2008 at 2013-03-06 11:12:30
试剂盒回收的片段，杂质很多，很影响后续的连接效率。所以我也建议不回收，直接“酒精+醋酸钠沉降”后做酶切，你甚至也可以直接在PCR反应后的体系里直接加内切酶和BSA，不过这种办法不够严谨，构个普通的载体可以， ...

嗯，谢谢！
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23楼2013-03-06 22:05:54
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l68266152

银虫 (小有名气)
★
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我们实验室的方案是先将pcr产物连接TA克隆载体，从载体上酶切回收，再来连接表达载体，步骤多点，但效率很高。
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24楼2013-03-07 09:56:32
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
★
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我也是用PCR产物纯化后直接连接载体的 ，效率非常非常的 低
不知你最后是怎么解决的？
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25楼2013-09-21 21:59:08
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
17楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-05 18:57:58
如果切不开，楼主可以将PCR片段先构建在克隆载体上比如T载体，抽质粒再酶切回收你的片段，构建到目标载体上

我碰到类似问题也是通过构建到T载体上才解决的
不知这样的原因是什么？增加拷贝数？
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26楼2013-09-21 22:03:16
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)
将你PCR产物回收之后尽量浓缩一下，因为片段越浓连接效率越高
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27楼2013-10-09 10:09:48
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Alphard02

新虫 (初入文坛)
★
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21楼: Originally posted by zltj2008 at 2013-03-06 11:12:30
试剂盒回收的片段，杂质很多，很影响后续的连接效率。所以我也建议不回收，直接“酒精+醋酸钠沉降”后做酶切，你甚至也可以直接在PCR反应后的体系里直接加内切酶和BSA，不过这种办法不够严谨，构个普通的载体可以， ...

最近用中国药典的PCR-RFLP方法鉴定川贝母，用商业试剂盒扩增后直接进行Sma I 酶切，可是酶切效率一直上不去。不知道将PCR产物纯化后会不会好一些？？
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28楼2019-03-28 13:45:57
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Alphard02

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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17楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-05 18:57:58
如果切不开，楼主可以将PCR片段先构建在克隆载体上比如T载体，抽质粒再酶切回收你的片段，构建到目标载体上

最近用中国药典的PCR-RFLP方法鉴定川贝母，用方州华韵的商业试剂盒扩增后直接进行Sma I 酶切，可是酶切效率一直上不去。不知道将PCR产物纯化后会不会好一些？？酶用过试剂盒自带的和TaRaka的1085S，试剂盒自带体系为25μL PCR产物中直接加入1μL酶，TaRaka酶的体系为：Sma I 6μL；10*  T Buffer 2μL；0.1% BSA 2μL；PCR产物5μL（测浓度为610ng/μL）；灭菌水5μL。求教问题会出在哪里？？
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29楼2019-03-28 13:55:44
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yingying15887楼
2013-03-02 23:18   回复  
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