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201014162

金虫 (正式写手)

[交流] 蓝白斑筛选没问题，挑白色克隆测序无目的基因序列

最近在做克隆测序，先PCR产物纯化后连接载体PMD18-T，然后转化到JM1O9的感受态细胞，蓝白斑筛选蓝色和白色都有菌落，挑白色菌落培养后送上海生工测序，用的通用引物M13，结果上vecscreen比对，大部分不包含我的目的基因序列，相似度最大的竟然是PBR322载体，很郁闷，测了好多次了都这样，请高手指教！
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1楼 2012-11-27 16:21:44
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
★
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前确定下是没插入的假阳性，还是PCR 产物不纯连入了非特异条带。前者的话，就是实验技巧的问题；更可能是后者，你把扩增的片段切胶回收后再连。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2012-11-27 18:50:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
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如果假阳性很多，可能是克隆的目的片段有问题，最好重新做一下。一般挑了白斑克隆后提下质粒酶切鉴定后再送测序。
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3楼2012-11-28 08:31:12
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201014162

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-27 18:50:37
前确定下是没插入的假阳性，还是PCR 产物不纯连入了非特异条带。前者的话，就是实验技巧的问题；更可能是后者，你把扩增的片段切胶回收后再连。

恩  我是PCR产物切胶回收后再做的连接，如果假阳性的话那在vecscreen上检索的话是不是应该也能检索的序列，我的结果都在PBR322载体的序列，
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4楼2012-11-28 16:29:49
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201014162

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-28 08:31:12
如果假阳性很多，可能是克隆的目的片段有问题，最好重新做一下。一般挑了白斑克隆后提下质粒酶切鉴定后再送测序。

最近正在重做，谢谢啊
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5楼2012-11-28 16:30:49
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 201014162 at 2012-11-28 16:29:49
恩  我是PCR产物切胶回收后再做的连接，如果假阳性的话那在vecscreen上检索的话是不是应该也能检索的序列，我的结果都在PBR322载体的序列，...

看来是假阳性居多。需要注意的地方是，抗生素、诱导物、染料等是否失效；涂布均匀；挑选的白斑尽量挨着蓝斑；尽量不要挑选平板边缘的菌落。祝你好运！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2012-11-28 18:37:27
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jw1985629

新虫 (初入文坛)
★
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不要只挑白斑后摇菌就送出去测序，要自己先做菌体PCR或者酶切跑胶鉴定下再送出去，你这种情况应该是酶切后没做胶回收直接连接了吧？我之前遇见过。希望能帮到你
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7楼2012-11-28 20:41:00
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bloodwar

银虫 (小有名气)
★
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双酶切验证下吧，应该是自连了
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9楼2012-11-29 05:16:17
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1390325032

铁虫 (初入文坛)
★
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想请教下在测序之前，为什么要进行蓝白斑筛选，并且挑选白色菌落测序呢？
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10楼2015-05-14 09:05:31
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su-b088楼
2012-11-28 21:25   回复  
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