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201014162

金虫 (正式写手)


[交流] 蓝白斑筛选没问题,挑白色克隆测序无目的基因序列

最近在做克隆测序,先PCR产物纯化后连接载体PMD18-T,然后转化到JM1O9的感受态细胞,蓝白斑筛选蓝色和白色都有菌落,挑白色菌落培养后送上海生工测序,用的通用引物M13,结果上vecscreen比对,大部分不包含我的目的基因序列,相似度最大的竟然是PBR322载体,很郁闷,测了好多次了都这样,请高手指教!
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zhaodahe

木虫 (正式写手)



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前确定下是没插入的假阳性,还是PCR 产物不纯连入了非特异条带。前者的话,就是实验技巧的问题;更可能是后者,你把扩增的片段切胶回收后再连。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2012-11-27 18:50:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)



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如果假阳性很多,可能是克隆的目的片段有问题,最好重新做一下。一般挑了白斑克隆后提下质粒酶切鉴定后再送测序。
3楼2012-11-28 08:31:12
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201014162

金虫 (正式写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-27 18:50:37
前确定下是没插入的假阳性,还是PCR 产物不纯连入了非特异条带。前者的话,就是实验技巧的问题;更可能是后者,你把扩增的片段切胶回收后再连。

恩  我是PCR产物切胶回收后再做的连接,如果假阳性的话那在vecscreen上检索的话是不是应该也能检索的序列,我的结果都在PBR322载体的序列,
4楼2012-11-28 16:29:49
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201014162

金虫 (正式写手)


引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-28 08:31:12
如果假阳性很多,可能是克隆的目的片段有问题,最好重新做一下。一般挑了白斑克隆后提下质粒酶切鉴定后再送测序。

最近正在重做,谢谢啊
5楼2012-11-28 16:30:49
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zhaodahe

木虫 (正式写手)



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引用回帖:
4楼: Originally posted by 201014162 at 2012-11-28 16:29:49
恩  我是PCR产物切胶回收后再做的连接,如果假阳性的话那在vecscreen上检索的话是不是应该也能检索的序列,我的结果都在PBR322载体的序列,...

看来是假阳性居多。需要注意的地方是,抗生素、诱导物、染料等是否失效;涂布均匀;挑选的白斑尽量挨着蓝斑;尽量不要挑选平板边缘的菌落。祝你好运!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
6楼2012-11-28 18:37:27
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jw1985629

新虫 (初入文坛)



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不要只挑白斑后摇菌就送出去测序,要自己先做菌体PCR或者酶切跑胶鉴定下再送出去,你这种情况应该是酶切后没做胶回收直接连接了吧?我之前遇见过。希望能帮到你
7楼2012-11-28 20:41:00
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bloodwar

银虫 (小有名气)



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双酶切验证下吧,应该是自连了
9楼2012-11-29 05:16:17
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1390325032

铁虫 (初入文坛)



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想请教下在测序之前,为什么要进行蓝白斑筛选,并且挑选白色菌落测序呢?
10楼2015-05-14 09:05:31
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su-b088楼
2012-11-28 21:25   回复  
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