| 查看: 2013 | 回复: 11 | |||
zzup金虫 (初入文坛)
|
[交流]
【求助/交流】反向PCR的问题 已有4人参与
|
| 最近在做反向PCR寻找启动子序列，随机对基因组酶切，环化以后做PCR总是很有许多条带，换条件减少非特异性扩增以后，还是有好几条带，而且电泳图都不怎么亮，求教是怎么回事？很郁闷。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
今天系统多次维护，明天很可能放榜！
已经有5人回复
-
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有74人回复
-
岩土工程学报什么时候才能终审完呐
已经有4人回复
-
时间戳又变了8-15
已经有25人回复
-
2027广东省杰青
已经有6人回复
-
快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。
已经有3人回复
-
哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？
已经有9人回复
-
咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否
已经有26人回复
-
我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人
已经有16人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有12人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 寻找好心人，帮帮我，关于引物以及PCR的问题！
已经有7人回复
- PCR扩增法制备低拷贝质粒（替代常规质粒提取）
已经有11人回复
- 求教DGGE相关的基本问题（做过的请指教）
已经有8人回复
- 重叠pcr\跳跃pcr的问题
已经有14人回复
- 细菌16s pcr原液测序问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】连接产物，是否可以直接做PCR模板？
已经有17人回复
- 【求助/交流】定点突变-DpnI消化
已经有12人回复
- 【求助/交流】反向PCR的问题
已经有4人回复
- 【求助/交流】求助基因克隆方面的问题解决方案
已经有17人回复
- 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题
已经有21人回复
fungixx
至尊木虫 (文坛精英)
- MicEPI: 2
- 应助: 37 (小学生)
- 贵宾: 3.458
- 金币: 19627.6
- 散金: 18645
- 红花: 118
- 沙发: 273
- 帖子: 13324
- 在线: 2030.8小时
- 虫号: 860534
- 注册: 2009-09-30
- 专业: 抗肿瘤药物药理
2楼2010-06-24 16:58:12
zzup
金虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1219.1
- 散金: 9
- 帖子: 44
- 在线: 16.6小时
- 虫号: 1038257
- 注册: 2010-06-08
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2010-06-24 19:44:44
zemin_fang
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 3643.4
- 红花: 4
- 帖子: 327
- 在线: 79.2小时
- 虫号: 465566
- 注册: 2007-11-22
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2010-06-24 20:00:31
ben1147
木虫 (正式写手)
- 应助: 18 (小学生)
- 贵宾: 0.003
- 金币: 5847.6
- 红花: 6
- 帖子: 952
- 在线: 116.9小时
- 虫号: 709538
- 注册: 2009-02-26
- 专业: 微生物生理与生物化学
★ ★ ★ ★
amisking(金币+4):很好的意见！ 2010-06-24 20:18:53
amisking(金币+4):很好的意见！ 2010-06-24 20:18:53
|
首先确定引物本身特异性不能太差，1000多bp的已知序列，余地不小了，设计两对比较好的引物应该不难吧？反向PCR里巢式还是建议要做的。引物实在不好设计的话至少也要设计三条引物，一边不变一边巢式。 连接体系中DNA的终浓度是多少？浓度过高的话倾向于分子间连接，P出来就会有非特异条带。酶切产物纯化之后测一下浓度，比较高的话要稀释一下。理论上讲连接体系里DNA终浓度最好低于3ng/uL 另外做反向本来就是一个碰运气的过程，一定多用几种酶切。有时候自连是成功的，但是两引物间距离太长，超过了Taq酶所能扩增的能力，也会P不出来，引物不能被消耗，非特异扩增就出来了。用上五六种以上酶，至少总有一种大小是合适的 又有非特异扩增，目的条带又不亮的话，还是建议优化一下PCR的条件 |
5楼2010-06-24 20:05:24
zzup
金虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1219.1
- 散金: 9
- 帖子: 44
- 在线: 16.6小时
- 虫号: 1038257
- 注册: 2010-06-08
- 专业: 微生物生理与生物化学
6楼2010-06-24 20:13:40
ben1147
木虫 (正式写手)
- 应助: 18 (小学生)
- 贵宾: 0.003
- 金币: 5847.6
- 红花: 6
- 帖子: 952
- 在线: 116.9小时
- 虫号: 709538
- 注册: 2009-02-26
- 专业: 微生物生理与生物化学
7楼2010-06-24 20:23:02
zzup
金虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1219.1
- 散金: 9
- 帖子: 44
- 在线: 16.6小时
- 虫号: 1038257
- 注册: 2010-06-08
- 专业: 微生物生理与生物化学
8楼2010-06-24 20:36:26
ben1147
木虫 (正式写手)
- 应助: 18 (小学生)
- 贵宾: 0.003
- 金币: 5847.6
- 红花: 6
- 帖子: 952
- 在线: 116.9小时
- 虫号: 709538
- 注册: 2009-02-26
- 专业: 微生物生理与生物化学
9楼2010-06-24 20:40:24
zzup
金虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1219.1
- 散金: 9
- 帖子: 44
- 在线: 16.6小时
- 虫号: 1038257
- 注册: 2010-06-08
- 专业: 微生物生理与生物化学
10楼2010-06-24 20:43:59
25