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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】反向PCR的问题
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zzup

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】反向PCR的问题 已有4人参与

最近在做反向PCR寻找启动子序列，随机对基因组酶切，环化以后做PCR总是很有许多条带，换条件减少非特异性扩增以后，还是有好几条带，而且电泳图都不怎么亮，求教是怎么回事？很郁闷。。
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1楼 2010-06-24 16:18:00
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zzup at 2010-06-24 20:13:40:
4楼  我有两端的引物，就是P出来有好几条带，因为模板是基因组DNA，杂质比较多，消化时间1h不敢太长，所以消化彻底不也不清楚，酶切纯化后电泳看不见条带，是不是模板浓度太少了？

基因组酶切一定要彻底，不然大部分都没有相应的粘性末端，就没法连接了

电泳有没有条带倒问题不大，本来酶切就是不均匀的，产物大小会在一个大概的区间，不会都是一样长而形成条带的
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7楼2010-06-24 20:23:02
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
zzup(金币+1): 2010-06-24 19:43:11
设计几条基因特异性引物，做巢氏pcr可以降低非特异性扩增
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-06-24 16:58:12
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zzup

金虫 (初入文坛)
我是随机的酶切后做自身连接环化，环化后DNA大小也不知，就知道个1000多bp的功能基因序列，根本没办法设计两对引物巢式P
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3楼2010-06-24 19:44:44
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
zzup(金币+1): 2010-06-24 20:15:12
在已知1000bp距离两端50-100bp处设计两个特异性引物，酶切产物一定要充分消化，连接体系中分子数要少。
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4楼2010-06-24 20:00:31
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