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zzup

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】反向PCR的问题已有4人参与

最近在做反向PCR寻找启动子序列,随机对基因组酶切,环化以后做PCR总是很有许多条带,换条件减少非特异性扩增以后,还是有好几条带,而且电泳图都不怎么亮,求教是怎么回事?很郁闷。。
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ben1147

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zzup at 2010-06-24 20:13:40:
4楼  我有两端的引物,就是P出来有好几条带,因为模板是基因组DNA,杂质比较多,消化时间1h不敢太长,所以消化彻底不也不清楚,酶切纯化后电泳看不见条带,是不是模板浓度太少了?

基因组酶切一定要彻底,不然大部分都没有相应的粘性末端,就没法连接了

电泳有没有条带倒问题不大,本来酶切就是不均匀的,产物大小会在一个大概的区间,不会都是一样长而形成条带的
7楼2010-06-24 20:23:02
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

zzup(金币+1): 2010-06-24 19:43:11
设计几条基因特异性引物,做巢氏pcr可以降低非特异性扩增
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-06-24 16:58:12
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zzup

金虫 (初入文坛)

我是随机的酶切后做自身连接环化,环化后DNA大小也不知,就知道个1000多bp的功能基因序列,根本没办法设计两对引物巢式P
3楼2010-06-24 19:44:44
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zemin_fang

木虫 (正式写手)

zzup(金币+1): 2010-06-24 20:15:12
在已知1000bp距离两端50-100bp处设计两个特异性引物,酶切产物一定要充分消化,连接体系中分子数要少。
4楼2010-06-24 20:00:31
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