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zzup金虫 (初入文坛)
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[交流]
【求助/交流】反向PCR的问题 已有4人参与
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| 最近在做反向PCR寻找启动子序列，随机对基因组酶切，环化以后做PCR总是很有许多条带，换条件减少非特异性扩增以后，还是有好几条带，而且电泳图都不怎么亮，求教是怎么回事？很郁闷。。 |
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zzup
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amisking(金币+4):很好的意见！ 2010-06-24 20:18:53
amisking(金币+4):很好的意见！ 2010-06-24 20:18:53
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首先确定引物本身特异性不能太差，1000多bp的已知序列，余地不小了，设计两对比较好的引物应该不难吧？反向PCR里巢式还是建议要做的。引物实在不好设计的话至少也要设计三条引物，一边不变一边巢式。 连接体系中DNA的终浓度是多少？浓度过高的话倾向于分子间连接，P出来就会有非特异条带。酶切产物纯化之后测一下浓度，比较高的话要稀释一下。理论上讲连接体系里DNA终浓度最好低于3ng/uL 另外做反向本来就是一个碰运气的过程，一定多用几种酶切。有时候自连是成功的，但是两引物间距离太长，超过了Taq酶所能扩增的能力，也会P不出来，引物不能被消耗，非特异扩增就出来了。用上五六种以上酶，至少总有一种大小是合适的 又有非特异扩增，目的条带又不亮的话，还是建议优化一下PCR的条件 |
5楼2010-06-24 20:05:24
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