24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zzup

金虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1219.1
散金: 9
帖子: 44
在线: 16.6小时
虫号: 1038257
注册: 2010-06-08
专业: 微生物生理与生物化学

[交流] 【求助/交流】反向PCR的问题已有4人参与

最近在做反向PCR寻找启动子序列，随机对基因组酶切，环化以后做PCR总是很有许多条带，换条件减少非特异性扩增以后，还是有好几条带，而且电泳图都不怎么亮，求教是怎么回事？很郁闷。。

回复此楼

» 猜你喜欢

博士读完未来一定会好吗已经有21人回复
导师想让我从独立一作变成了共一第一已经有5人回复
到新单位后，换了新的研究方向，没有团队，持续积累2区以上论文，能申请到面上吗已经有11人回复
读博已经有4人回复
JMPT 期刊投稿流程已经有4人回复
心脉受损已经有5人回复
Springer期刊投稿求助已经有4人回复
小论文投稿已经有3人回复
Bioresource Technology期刊，第一次返修的时候被退回好几次了已经有9人回复
申请2026年博士已经有6人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

1楼2010-06-24 16:18:00

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)

应助: 18 (小学生)
贵宾: 0.003
金币: 5847.6
红花: 6
帖子: 952
在线: 116.9小时
虫号: 709538
注册: 2009-02-26
专业: 微生物生理与生物化学

★ ★ ★ ★
amisking(金币+4):很好的意见！ 2010-06-24 20:18:53

首先确定引物本身特异性不能太差，1000多bp的已知序列，余地不小了，设计两对比较好的引物应该不难吧？反向PCR里巢式还是建议要做的。引物实在不好设计的话至少也要设计三条引物，一边不变一边巢式。

连接体系中DNA的终浓度是多少？浓度过高的话倾向于分子间连接，P出来就会有非特异条带。酶切产物纯化之后测一下浓度，比较高的话要稀释一下。理论上讲连接体系里DNA终浓度最好低于3ng/uL

另外做反向本来就是一个碰运气的过程，一定多用几种酶切。有时候自连是成功的，但是两引物间距离太长，超过了Taq酶所能扩增的能力，也会P不出来，引物不能被消耗，非特异扩增就出来了。用上五六种以上酶，至少总有一种大小是合适的

又有非特异扩增，目的条带又不亮的话，还是建议优化一下PCR的条件