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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】反向PCR的问题
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zzup

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】反向PCR的问题 已有4人参与

最近在做反向PCR寻找启动子序列，随机对基因组酶切，环化以后做PCR总是很有许多条带，换条件减少非特异性扩增以后，还是有好几条带，而且电泳图都不怎么亮，求教是怎么回事？很郁闷。。
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1楼 2010-06-24 16:18:00
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
zzup(金币+1): 2010-06-24 20:15:12
在已知1000bp距离两端50-100bp处设计两个特异性引物，酶切产物一定要充分消化，连接体系中分子数要少。
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4楼2010-06-24 20:00:31
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
zzup(金币+1): 2010-06-24 19:43:11
设计几条基因特异性引物，做巢氏pcr可以降低非特异性扩增
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-06-24 16:58:12
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zzup

金虫 (初入文坛)
我是随机的酶切后做自身连接环化，环化后DNA大小也不知，就知道个1000多bp的功能基因序列，根本没办法设计两对引物巢式P
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3楼2010-06-24 19:44:44
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
amisking(金币+4):很好的意见！ 2010-06-24 20:18:53
首先确定引物本身特异性不能太差，1000多bp的已知序列，余地不小了，设计两对比较好的引物应该不难吧？反向PCR里巢式还是建议要做的。引物实在不好设计的话至少也要设计三条引物，一边不变一边巢式。

连接体系中DNA的终浓度是多少？浓度过高的话倾向于分子间连接，P出来就会有非特异条带。酶切产物纯化之后测一下浓度，比较高的话要稀释一下。理论上讲连接体系里DNA终浓度最好低于3ng/uL

另外做反向本来就是一个碰运气的过程，一定多用几种酶切。有时候自连是成功的，但是两引物间距离太长，超过了Taq酶所能扩增的能力，也会P不出来，引物不能被消耗，非特异扩增就出来了。用上五六种以上酶，至少总有一种大小是合适的

又有非特异扩增，目的条带又不亮的话，还是建议优化一下PCR的条件
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5楼2010-06-24 20:05:24
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