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lishaohe

新虫 (小有名气)


[交流] PCR产物纯化后酶切,连接

最近需要通过PCR产物,酶切,连接转化B L21建菌库,但是PCR产物酶切,连接转化效率很低,请问各位大虾,有没有更好的办法。引物加了保护碱基。或者更好的建库方案,谢谢!
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lishaohe

新虫 (小有名气)


送鲜花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by dayulee at 2013-03-05 08:07:29
还有酶的活性,是哪个公司的呢?你的产物是不是经过纯化过或其他成分影响了酶活?另外,还有连接的时候你的流程是什么,具体描述下呗

产物都是经过胶回收(试剂盒),然后做的双酶切,酶切是37°,一般切3-4h。然后连接,我们实验室一般采用的是25°,T4连接酶连接3-4h,也16°连接过夜过。效果都不怎么好。酶肯定是没有问题的,切PUC质粒就很好。
18楼2013-03-05 22:47:26
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peakg7

新虫 (小有名气)



lishaohe(金币+3): 谢谢参与
送鲜花一朵
pcr产物直接回收,不要跑胶回收,效率会提高很多倍。
2楼2013-03-02 15:30:00
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lishaohe

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by peakg7 at 2013-03-02 15:30:00
pcr产物直接回收,不要跑胶回收,效率会提高很多倍。

我们就是直接回收的,片段很亮。直接用的就是PCR产物回收试剂盒
3楼2013-03-02 15:40:08
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peakg7

新虫 (小有名气)


引用回帖:
3楼: Originally posted by lishaohe at 2013-03-02 15:40:08
我们就是直接回收的,片段很亮。直接用的就是PCR产物回收试剂盒...

酶切效率不高,连接酶的问题?
4楼2013-03-02 16:15:41
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