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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 平末端连接做不出来克隆
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320080920001

金虫 (正式写手)

[求助] 平末端连接做不出来克隆

大家好，我最近在做克隆，是把我以前做过的一个基因的点突变后的质粒（pFastbac1-GENE）设计引物（F和R，在R引物上带有PmlI的酶切位点，F和R内侧附近分别有PmlI和KpnI位点，均为单酶切位点），PCR完了后溶液回收Kit回收，浓度大概130ng/ul,70ul elute，之后我用PmlI和KpnI切（此处犯了一个错误，应该只用PmlI切，这样就不用后面切平了），然后跑胶，切胶回收，用的是Qiagen的胶回收试剂盒，浓度大概为30ng/ul,50ul eltue,而且260/230的值不到0.1，很低。然后用Klenow酶（large fragment）切平KpnI的位点，然后溶液回收。我把pEF-GENE用PmlI酶切（在我要替换的片段上下游有两个PmlI酶切位点），跑胶回收vector，浓度是60ng/ul。用CIP酶处理后消除5‘磷酸，防止自连。然后溶液回收。
最后用T4liase把insert和vector连接起来，转化涂板，我试过DH5a和T1，都没有长出来，这个质粒要的很急，最近我也快做完毕业设计回去答辩了，由于最后这个实验不顺利，我都不知道老板会不会要我，虽然我很想留在她的实验室。最近给自己的压力好大啊！
P.S.求技术指导，关心酱油之类的回帖不回勿怪哈！我后面有用pEF-GENE为模板做点突变PCR，但是由于片段是9KB左右，很难P出来。还在平行做PCR后用PmlI单酶切，这样就不用连接了，还在想要不要再设计一下引物，就在紧挨片段上下游，再做PCR，这样酶切后就不用胶回收，直接溶液回收了。
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1楼2012-04-21 10:39:32
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lliu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
320080920001: 金币+2, ★有帮助, 谢谢，但是我的PCR产物是需要PmlI酶切的 用高浓度T4 ligase 是指怎样的反应体系呢？好像做不了蓝白筛选吧 2012-04-22 12:23:12
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 有道理的 2012-04-24 10:13:07
1，不要对载体去磷酸化。
2，直接连PCR产物（胶纯化后）。
3，用高浓度T4 ligase.
4, 用蓝白筛选。
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4楼2012-04-22 03:50:41
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320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-04-22 12:30:32
最新动态 我又做了一次PCR,溶液回收后，只用PmlI酶切，胶回收后连接，还是不行。崩溃了！
另外，我尝试直接做点突变PCR，试过58度(30s）->72度(5min)；68度（30s）->72度（8min）;均未成功！载体是9KB左右，我之前用FastPFU扩7KB的载体，都work呀！要死了！
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6楼2012-04-22 12:30:28
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
320080920001: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 很有经验啊！ 2012-04-23 00:23:04
320080920001: 回帖置顶 2012-04-23 00:42:31
silicare: BioEPI+1 2012-04-24 10:10:48
320080920001: 金币+6, ★有帮助, 谢谢 2012-05-08 00:10:56
上面的几位我不能说什么但是基本都没说到点上，去磷酸化是必须的，不然自恋的概率非常大，建议这样做：
1 你用PCR产物做，请问是否使用的是高保真酶，如果是的话可以不用平末端酶切，建议使用T4核苷酸激酶加磷酸基，但理论是来说酶切也不是不可以，只是你使用的这个酶所切出来的平末端连接效率可能比较低（和酶有很大关系）。
2 转化涂板用VECTOR自连作对照，看看你去磷酸化的效果，平末端连接最好作对照。
3 什么都没有长说明载体自连都不存在，那么考虑一下是否抗生素出现问题，检查一下实验材料。
4 不知道你的载体是否也是酶切后变成的平末端，如果是这样，建议连接的时候温度放置在22度，并加入适量切你载体的内切酶，可以比较有效的防止自连，在这个温度下连接时间要超过24小时，否则失败的可能性很大。
5 如果T4连接酶不好用，建议使用TAKARA的SOLUTION I溶液，连接效率会高很多。
6 如果有PEG 4000或者PEG 8000可以适量加入，增加平末端连接效率。
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320080920001
10楼2012-04-22 22:25:56
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320080920001

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
送鲜花一朵
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:11:26
引用回帖:
10楼: Originally posted by huguangdong at 2012-04-22 22:25:56:
上面的几位我不能说什么但是基本都没说到点上，去磷酸化是必须的，不然自恋的概率非常大，建议这样做：
1 你用PCR产物做，请问是否使用的是高保真酶，如果是的话可以不用平末端酶切，建议使用T4核苷酸激酶加磷酸 ...

1.我是用的easyTaq扩的，不过下次可以尝试用FastPfu,不过T4核苷酸激酶加磷酸基（我们实验室有PNK），你是担心PmlI酶切的片段可能5‘端没有磷酸是吧？
2.我有做vector自连的对照，但目前还没结果，但是就像你第3条说的，什么也没长确实是自连不存在问题，我的板子是amp的，当时配了很多，师兄也在用这一批板子，我可以确认一下有没有问题，但是好像师兄已经做出来了（他自己的实验）。
4.我的vector和insert都是平末端，而且10ul的连接体系，其中加了1ul(63ng/ul)的vector（约9KB），2ul(30ng/ul)的insert(约500bp),16度连接O/N,然后取1ul跑胶，9ul转化，没有出来，上胶图。我担心22度是否会破坏T4 ligase的酶活性，我都是在冰上操作，然后移到PCR仪中16度过夜酶切。不过我可以试试22度超24小时。不知道成功率多大，是否有尝试的必要，话说和老板trouble shooting的时候老板很鄙视的说她以前做的时候做了很多平末端连接，弱爆了的感觉啊，毕竟她发过Cell，只能信了啊。
5.是指不用T4 ligase buffer,改用 T4 ligase+Solution I吗？我找找。
6.PEG8000实验室的同学刚分装好，推荐使用，不过他使用来连linker的，做的是大体系的反应，不知道可不可以用来做常规的连接转化实验，是否会对后面的转化有影响。
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11楼2012-04-23 00:42:24
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:18:24
引用回帖:
11楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-04-23 00:42:24:
1.我是用的easyTaq扩的，不过下次可以尝试用FastPfu,不过T4核苷酸激酶加磷酸基（我们实验室有PNK），你是担心PmlI酶切的片段可能5‘端没有磷酸是吧？
2.我有做vector自连的对照，但目前还没结果，但是就像你第3 ...

1 酶切一般都会有磷酸基，或许是我多疑，但这个酶的酶切效率有多高建议你查一下。
2 连接最好别用PCR仪，况且平末端连接一般都需要16小时以上（经验之谈），废仪器又感觉时间不够。
3 发CELL的人未必做这些实验，只是她那么想而已，想当然的事情不可当真，只有自己做了才知道。
4 Solution I是BUFFER和连接酶的混合体，是改进了的连接液体，连接时只加这个东西，具体加法参照试剂说明书。
5 还有22度连接要加入内切酶，除非你的骨架载体不是酶切形成的。
6 对转化没有任何影响，不过就个人经验来说，PEG的因素不是最主要的，也可以不加。
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12楼2012-04-23 01:19:29
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AnaSequence

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励新虫发帖交流 2012-04-24 10:21:02
没叙述清楚,不知道引物F有没有PmeI酶切位点，如果没有，建议还是用高保真酶，免得在其末端引入其他碱基，没得到平末端；载体去磷酸化是必须的。
方案设计不合理，如果下面的改动不影响，试试改一下：
方案1，插入片段不要加PmeI等酶切位点，直接引物磷酸化后高保真酶PCR，连接到PmeI酶切去磷酸化载体，这种情况下，加PmeI才会只切开载体而不是重组质粒，插入片段既然是平末端连接，用的酶又不是常见酶，不如直接高保真PCR得到平末端；
方案2，载体经过PmeI酶切后用聚合酶在末端加T，插入片段用非高保真酶PCR，进行TA克隆。
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20楼2012-04-24 09:14:18
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320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-04-28 19:43:10
前几天和老板一起去苏州听冷泉港亚洲会议去了 没有做实验 现在把载体的图发上来 不过我还是得做平末端连接 不知道怎么办啊 主要是没找到失败原因
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22楼2012-04-28 18:29:10
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320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-04-28 19:44:58
补图片
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23楼2012-04-28 19:44:48
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320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-05-08 00:09:53
各位好 我的连接做出来了 原因我觉得是T4 ligase buffer的问题，我重新订了一管酶和buffer，连接体系不变，就做出来了，后来16度连接两小时（老板逼的，我是不相信，可是结果让我不得不信了），也出来了。 结果有些戏剧性，不过还是挺感谢那些给出建议和分析的好心人，我也给你人回过贴，知道强忍着分析一个问题的不易，感谢你们，祝大家实验顺利，多发Paper。 有一句话，叫做出来的实验都一样，失败的实验千万种啊！
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25楼2012-05-08 00:09:44
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320080920001

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, 应助指数+1, 谢谢反馈 2012-04-24 10:19:58
图片中是做了片段和载体PmlI酶切后连接，跑胶的结果，左边的是目的基因的连接结果， 右边两个是从载体切下来的小片段和载体再次连接以及空载体连接。
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16楼2012-04-23 03:56:37
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普通回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
求助啊
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2楼2012-04-21 10:48:26
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320080920001

金虫 (正式写手)
为何没人应助呢？是金币太少了吗？
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3楼2012-04-21 16:37:02
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
320080920001: 金币+2, ★有帮助, 是的 但是我这些步骤都很必须啊 不知道应该怎样简化呢？ 2012-04-22 12:24:32
我觉得你好是不要切胶，回收之类的，你的操作步骤越多，损失的越多，虽然你都测了浓度，但不保准啊，希望你试验顺利啊
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我努力我奋斗我成功
5楼2012-04-22 11:02:06
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lys6827

木虫 (著名写手)
找找试剂的应用支持问问
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7楼2012-04-22 13:28:12
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freerain

禁虫 (职业作家)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 鼓励应助，谢谢交流` 2012-04-22 20:10:30
320080920001: 金币+1, ★有帮助, 我的比例是10:1，16度过夜 2012-04-23 00:21:08
本帖内容被屏蔽
8楼2012-04-22 14:31:56
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sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
320080920001: 金币+1, ★有帮助, 是指fermentas的酶吗？pfu不是扩出来平末端吗？ 2012-04-23 00:22:13
高保真酶扩增的片段载体是不能脱磷的用Ferment连接酶
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9楼2012-04-22 22:19:39
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