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320080920001金虫 (正式写手)
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[求助]
平末端连接做不出来克隆
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大家好，我最近在做克隆，是把我以前做过的一个基因的点突变后的质粒（pFastbac1-GENE）设计引物（F和R，在R引物上带有PmlI的酶切位点，F和R内侧附近分别有PmlI和KpnI位点，均为单酶切位点），PCR完了后溶液回收Kit回收，浓度大概130ng/ul,70ul elute，之后我用PmlI和KpnI切（此处犯了一个错误，应该只用PmlI切，这样就不用后面切平了），然后跑胶，切胶回收，用的是Qiagen的胶回收试剂盒，浓度大概为30ng/ul,50ul eltue,而且260/230的值不到0.1，很低。然后用Klenow酶（large fragment）切平KpnI的位点，然后溶液回收。我把pEF-GENE用PmlI酶切（在我要替换的片段上下游有两个PmlI酶切位点），跑胶回收vector，浓度是60ng/ul。用CIP酶处理后消除5‘磷酸，防止自连。然后溶液回收。 最后用T4liase把insert和vector连接起来，转化涂板，我试过DH5a和T1，都没有长出来，这个质粒要的很急，最近我也快做完毕业设计回去答辩了，由于最后这个实验不顺利，我都不知道老板会不会要我，虽然我很想留在她的实验室。最近给自己的压力好大啊！ P.S.求技术指导，关心酱油之类的回帖不回勿怪哈！我后面有用pEF-GENE为模板做点突变PCR，但是由于片段是9KB左右，很难P出来。还在平行做PCR后用PmlI单酶切，这样就不用连接了，还在想要不要再设计一下引物，就在紧挨片段上下游，再做PCR，这样酶切后就不用胶回收，直接溶液回收了。 |
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【答案】应助回帖
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silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励新虫发帖交流 2012-04-24 10:21:02
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没叙述清楚,不知道引物F有没有PmeI酶切位点，如果没有，建议还是用高保真酶，免得在其末端引入其他碱基，没得到平末端；载体去磷酸化是必须的。 方案设计不合理，如果下面的改动不影响，试试改一下： 方案1，插入片段不要加PmeI等酶切位点，直接引物磷酸化后高保真酶PCR，连接到PmeI酶切去磷酸化载体，这种情况下，加PmeI才会只切开载体而不是重组质粒，插入片段既然是平末端连接，用的酶又不是常见酶，不如直接高保真PCR得到平末端； 方案2，载体经过PmeI酶切后用聚合酶在末端加T，插入片段用非高保真酶PCR，进行TA克隆。 |
20楼2012-04-24 09:14:18
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2楼2012-04-21 10:48:26
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