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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 平末端连接做不出来克隆
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lliu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
320080920001: 金币+2, ★有帮助, 谢谢，但是我的PCR产物是需要PmlI酶切的 用高浓度T4 ligase 是指怎样的反应体系呢？好像做不了蓝白筛选吧 2012-04-22 12:23:12
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 有道理的 2012-04-24 10:13:07
1，不要对载体去磷酸化。
2，直接连PCR产物（胶纯化后）。
3，用高浓度T4 ligase.
4, 用蓝白筛选。
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4楼2012-04-22 03:50:41
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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320080920001: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 很有经验啊！ 2012-04-23 00:23:04
320080920001: 回帖置顶 2012-04-23 00:42:31
silicare: BioEPI+1 2012-04-24 10:10:48
320080920001: 金币+6, ★有帮助, 谢谢 2012-05-08 00:10:56
上面的几位我不能说什么但是基本都没说到点上，去磷酸化是必须的，不然自恋的概率非常大，建议这样做：
1 你用PCR产物做，请问是否使用的是高保真酶，如果是的话可以不用平末端酶切，建议使用T4核苷酸激酶加磷酸基，但理论是来说酶切也不是不可以，只是你使用的这个酶所切出来的平末端连接效率可能比较低（和酶有很大关系）。
2 转化涂板用VECTOR自连作对照，看看你去磷酸化的效果，平末端连接最好作对照。
3 什么都没有长说明载体自连都不存在，那么考虑一下是否抗生素出现问题，检查一下实验材料。
4 不知道你的载体是否也是酶切后变成的平末端，如果是这样，建议连接的时候温度放置在22度，并加入适量切你载体的内切酶，可以比较有效的防止自连，在这个温度下连接时间要超过24小时，否则失败的可能性很大。
5 如果T4连接酶不好用，建议使用TAKARA的SOLUTION I溶液，连接效率会高很多。
6 如果有PEG 4000或者PEG 8000可以适量加入，增加平末端连接效率。
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320080920001
10楼2012-04-22 22:25:56
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320080920001

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:11:26
引用回帖:
10楼: Originally posted by huguangdong at 2012-04-22 22:25:56:
上面的几位我不能说什么但是基本都没说到点上，去磷酸化是必须的，不然自恋的概率非常大，建议这样做：
1 你用PCR产物做，请问是否使用的是高保真酶，如果是的话可以不用平末端酶切，建议使用T4核苷酸激酶加磷酸 ...

1.我是用的easyTaq扩的，不过下次可以尝试用FastPfu,不过T4核苷酸激酶加磷酸基（我们实验室有PNK），你是担心PmlI酶切的片段可能5‘端没有磷酸是吧？
2.我有做vector自连的对照，但目前还没结果，但是就像你第3条说的，什么也没长确实是自连不存在问题，我的板子是amp的，当时配了很多，师兄也在用这一批板子，我可以确认一下有没有问题，但是好像师兄已经做出来了（他自己的实验）。
4.我的vector和insert都是平末端，而且10ul的连接体系，其中加了1ul(63ng/ul)的vector（约9KB），2ul(30ng/ul)的insert(约500bp),16度连接O/N,然后取1ul跑胶，9ul转化，没有出来，上胶图。我担心22度是否会破坏T4 ligase的酶活性，我都是在冰上操作，然后移到PCR仪中16度过夜酶切。不过我可以试试22度超24小时。不知道成功率多大，是否有尝试的必要，话说和老板trouble shooting的时候老板很鄙视的说她以前做的时候做了很多平末端连接，弱爆了的感觉啊，毕竟她发过Cell，只能信了啊。
5.是指不用T4 ligase buffer,改用 T4 ligase+Solution I吗？我找找。
6.PEG8000实验室的同学刚分装好，推荐使用，不过他使用来连linker的，做的是大体系的反应，不知道可不可以用来做常规的连接转化实验，是否会对后面的转化有影响。
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11楼2012-04-23 00:42:24
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