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lliu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
320080920001: 金币+2, 有帮助, 谢谢,但是我的PCR产物是需要PmlI酶切的 用高浓度T4 ligase 是指怎样的反应体系呢?好像做不了蓝白筛选吧 2012-04-22 12:23:12
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 有道理的 2012-04-24 10:13:07
1,不要对载体去磷酸化。
2,直接连PCR产物(胶纯化后)。
3,用高浓度T4 ligase.
4, 用蓝白筛选。
4楼2012-04-22 03:50:41
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智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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320080920001: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 很有经验啊! 2012-04-23 00:23:04
320080920001: 回帖置顶 2012-04-23 00:42:31
silicare: BioEPI+1 2012-04-24 10:10:48
320080920001: 金币+6, 有帮助, 谢谢 2012-05-08 00:10:56
上面的几位我不能说什么但是基本都没说到点上,去磷酸化是必须的,不然自恋的概率非常大,建议这样做:
1 你用PCR产物做,请问是否使用的是高保真酶,如果是的话可以不用平末端酶切,建议使用T4核苷酸激酶加磷酸基,但理论是来说酶切也不是不可以,只是你使用的这个酶所切出来的平末端连接效率可能比较低(和酶有很大关系)。
2 转化涂板用VECTOR自连作对照,看看你去磷酸化的效果,平末端连接最好作对照。
3 什么都没有长说明载体自连都不存在,那么考虑一下是否抗生素出现问题,检查一下实验材料。
4 不知道你的载体是否也是酶切后变成的平末端,如果是这样,建议连接的时候温度放置在22度,并加入适量切你载体的内切酶,可以比较有效的防止自连,在这个温度下连接时间要超过24小时,否则失败的可能性很大。
5 如果T4连接酶不好用,建议使用TAKARA的SOLUTION I溶液,连接效率会高很多。
6 如果有PEG 4000或者PEG 8000可以适量加入,增加平末端连接效率。

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10楼2012-04-22 22:25:56
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320080920001

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:11:26
引用回帖:
10楼: Originally posted by huguangdong at 2012-04-22 22:25:56:
上面的几位我不能说什么但是基本都没说到点上,去磷酸化是必须的,不然自恋的概率非常大,建议这样做:
1 你用PCR产物做,请问是否使用的是高保真酶,如果是的话可以不用平末端酶切,建议使用T4核苷酸激酶加磷酸 ...

1.我是用的easyTaq扩的,不过下次可以尝试用FastPfu,不过T4核苷酸激酶加磷酸基(我们实验室有PNK),你是担心PmlI酶切的片段可能5‘端没有磷酸是吧?
2.我有做vector自连的对照,但目前还没结果,但是就像你第3条说的,什么也没长确实是自连不存在问题,我的板子是amp的,当时配了很多,师兄也在用这一批板子,我可以确认一下有没有问题,但是好像师兄已经做出来了(他自己的实验)。
4.我的vector和insert都是平末端,而且10ul的连接体系,其中加了1ul(63ng/ul)的vector(约9KB),2ul(30ng/ul)的insert(约500bp),16度连接O/N,然后取1ul跑胶,9ul转化,没有出来,上胶图。我担心22度是否会破坏T4 ligase的酶活性,我都是在冰上操作,然后移到PCR仪中16度过夜酶切。不过我可以试试22度超24小时。不知道成功率多大,是否有尝试的必要,话说和老板trouble shooting的时候老板很鄙视的说她以前做的时候做了很多平末端连接,弱爆了的感觉啊,毕竟她发过Cell,只能信了啊。
5.是指不用T4 ligase buffer,改用 T4 ligase+Solution I吗?我找找。
6.PEG8000实验室的同学刚分装好,推荐使用,不过他使用来连linker的,做的是大体系的反应,不知道可不可以用来做常规的连接转化实验,是否会对后面的转化有影响。
11楼2012-04-23 00:42:24
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