| 查看: 5702 | 回复: 30 | |||
| 本帖产生 5 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
320080920001金虫 (正式写手)
|
[求助]
平末端连接做不出来克隆
|
||
|
大家好，我最近在做克隆，是把我以前做过的一个基因的点突变后的质粒（pFastbac1-GENE）设计引物（F和R，在R引物上带有PmlI的酶切位点，F和R内侧附近分别有PmlI和KpnI位点，均为单酶切位点），PCR完了后溶液回收Kit回收，浓度大概130ng/ul,70ul elute，之后我用PmlI和KpnI切（此处犯了一个错误，应该只用PmlI切，这样就不用后面切平了），然后跑胶，切胶回收，用的是Qiagen的胶回收试剂盒，浓度大概为30ng/ul,50ul eltue,而且260/230的值不到0.1，很低。然后用Klenow酶（large fragment）切平KpnI的位点，然后溶液回收。我把pEF-GENE用PmlI酶切（在我要替换的片段上下游有两个PmlI酶切位点），跑胶回收vector，浓度是60ng/ul。用CIP酶处理后消除5‘磷酸，防止自连。然后溶液回收。 最后用T4liase把insert和vector连接起来，转化涂板，我试过DH5a和T1，都没有长出来，这个质粒要的很急，最近我也快做完毕业设计回去答辩了，由于最后这个实验不顺利，我都不知道老板会不会要我，虽然我很想留在她的实验室。最近给自己的压力好大啊！ P.S.求技术指导，关心酱油之类的回帖不回勿怪哈！我后面有用pEF-GENE为模板做点突变PCR，但是由于片段是9KB左右，很难P出来。还在平行做PCR后用PmlI单酶切，这样就不用连接了，还在想要不要再设计一下引物，就在紧挨片段上下游，再做PCR，这样酶切后就不用胶回收，直接溶液回收了。 |
回复此楼» 猜你喜欢
科研人应该花精力去思考如何解决问题，而不是去凝练问题
已经有11人回复
-
要骂人了，新模版改版就是要淡化问题凝练这种虚的东西，结果有个评委还在说凝练得不够
已经有17人回复
-
基金系统什么内容也没有
已经有10人回复
-
学科评审组评审是指会评吗？
已经有5人回复
-
梦想
已经有8人回复
-
面上合作单位盖章
已经有9人回复
-
面上函评意见出来了，像什么等级？
已经有17人回复
-
为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难
已经有14人回复
-
小白求助 投论文要求的highlights应该如何写
已经有4人回复
-
麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上）
已经有12人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
320080920001
金虫 (正式写手)
- BioEPI: 3
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 940.7
- 散金: 105
- 红花: 1
- 帖子: 567
- 在线: 89.9小时
- 虫号: 1043714
- 注册: 2010-06-18
- 专业: 免疫生物学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
送鲜花一朵
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:11:26
送鲜花一朵silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:11:26
|
1.我是用的easyTaq扩的，不过下次可以尝试用FastPfu,不过T4核苷酸激酶加磷酸基（我们实验室有PNK），你是担心PmlI酶切的片段可能5‘端没有磷酸是吧？ 2.我有做vector自连的对照，但目前还没结果，但是就像你第3条说的，什么也没长确实是自连不存在问题，我的板子是amp的，当时配了很多，师兄也在用这一批板子，我可以确认一下有没有问题，但是好像师兄已经做出来了（他自己的实验）。 4.我的vector和insert都是平末端，而且10ul的连接体系，其中加了1ul(63ng/ul)的vector（约9KB），2ul(30ng/ul)的insert(约500bp),16度连接O/N,然后取1ul跑胶，9ul转化，没有出来，上胶图。我担心22度是否会破坏T4 ligase的酶活性，我都是在冰上操作，然后移到PCR仪中16度过夜酶切。不过我可以试试22度超24小时。不知道成功率多大，是否有尝试的必要，话说和老板trouble shooting的时候老板很鄙视的说她以前做的时候做了很多平末端连接，弱爆了的感觉啊，毕竟她发过Cell，只能信了啊。 5.是指不用T4 ligase buffer,改用 T4 ligase+Solution I吗？我找找。 6.PEG8000实验室的同学刚分装好，推荐使用，不过他使用来连linker的，做的是大体系的反应，不知道可不可以用来做常规的连接转化实验，是否会对后面的转化有影响。   |
11楼2012-04-23 00:42:24
320080920001
金虫 (正式写手)
- BioEPI: 3
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 940.7
- 散金: 105
- 红花: 1
- 帖子: 567
- 在线: 89.9小时
- 虫号: 1043714
- 注册: 2010-06-18
- 专业: 免疫生物学
2楼2012-04-21 10:48:26
320080920001
金虫 (正式写手)
- BioEPI: 3
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 940.7
- 散金: 105
- 红花: 1
- 帖子: 567
- 在线: 89.9小时
- 虫号: 1043714
- 注册: 2010-06-18
- 专业: 免疫生物学
3楼2012-04-21 16:37:02
4楼2012-04-22 03:50:41
30