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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 平末端连接做不出来克隆
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320080920001

金虫 (正式写手)

[求助] 平末端连接做不出来克隆

大家好，我最近在做克隆，是把我以前做过的一个基因的点突变后的质粒（pFastbac1-GENE）设计引物（F和R，在R引物上带有PmlI的酶切位点，F和R内侧附近分别有PmlI和KpnI位点，均为单酶切位点），PCR完了后溶液回收Kit回收，浓度大概130ng/ul,70ul elute，之后我用PmlI和KpnI切（此处犯了一个错误，应该只用PmlI切，这样就不用后面切平了），然后跑胶，切胶回收，用的是Qiagen的胶回收试剂盒，浓度大概为30ng/ul,50ul eltue,而且260/230的值不到0.1，很低。然后用Klenow酶（large fragment）切平KpnI的位点，然后溶液回收。我把pEF-GENE用PmlI酶切（在我要替换的片段上下游有两个PmlI酶切位点），跑胶回收vector，浓度是60ng/ul。用CIP酶处理后消除5‘磷酸，防止自连。然后溶液回收。
最后用T4liase把insert和vector连接起来，转化涂板，我试过DH5a和T1，都没有长出来，这个质粒要的很急，最近我也快做完毕业设计回去答辩了，由于最后这个实验不顺利，我都不知道老板会不会要我，虽然我很想留在她的实验室。最近给自己的压力好大啊！
P.S.求技术指导，关心酱油之类的回帖不回勿怪哈！我后面有用pEF-GENE为模板做点突变PCR，但是由于片段是9KB左右，很难P出来。还在平行做PCR后用PmlI单酶切，这样就不用连接了，还在想要不要再设计一下引物，就在紧挨片段上下游，再做PCR，这样酶切后就不用胶回收，直接溶液回收了。
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1楼 2012-04-21 10:39:32
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320080920001

金虫 (正式写手)
为何没人应助呢？是金币太少了吗？
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3楼2012-04-21 16:37:02
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320080920001

金虫 (正式写手)
求助啊
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2楼2012-04-21 10:48:26
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lliu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
320080920001: 金币+2, ★有帮助, 谢谢，但是我的PCR产物是需要PmlI酶切的 用高浓度T4 ligase 是指怎样的反应体系呢？好像做不了蓝白筛选吧 2012-04-22 12:23:12
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 有道理的 2012-04-24 10:13:07
1，不要对载体去磷酸化。
2，直接连PCR产物（胶纯化后）。
3，用高浓度T4 ligase.
4, 用蓝白筛选。
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4楼2012-04-22 03:50:41
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
320080920001: 金币+2, ★有帮助, 是的 但是我这些步骤都很必须啊 不知道应该怎样简化呢？ 2012-04-22 12:24:32
我觉得你好是不要切胶，回收之类的，你的操作步骤越多，损失的越多，虽然你都测了浓度，但不保准啊，希望你试验顺利啊
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我努力我奋斗我成功
5楼2012-04-22 11:02:06
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