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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：请问做TOPO克隆时总是连接不上怎么回事啊？
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王玉民

新虫 (小有名气)

[求助] 求助：请问做TOPO克隆时总是连接不上怎么回事啊？

请教高手：
我用Pfu酶扩增得到大约500bp的片段，与TOPO载体连接时，连接转化后总是不长斑是怎么回事啊？
有没有做过TOPO克隆的有什么好的经验指导一下啊？
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心晴
1楼 2011-10-11 09:25:09
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另一个天堂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助发帖！ 2011-10-11 21:56:13
1.涂板：玻璃棒温度过高或离酒精灯太近被烧死了：或者涂板时液体没涂干
2.确定目的基因是否连接上了载体
3.检验一下你的扩增片段
4.考虑是不是培养基的问题
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2楼2011-10-11 09:58:25
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王玉民

新虫 (小有名气)
多谢！再请问1.如何确定是否连接上了载体？
2.如何检测扩增片段是否正确，大小用琼脂糖检测的是正确的，末端如何检测呢？
3.连接产物和感受态的比例多少最合适呢？
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心晴
3楼2011-10-11 10:18:05
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

不会是感受态效率不高所致吧？
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在等待中涅槃重生
4楼2011-10-11 14:36:47
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
1楼: Originally posted by 王玉民 at 2011-10-11 09:25:09:
请教高手：
我用Pfu酶扩增得到大约500bp的片段，与TOPO载体连接时，连接转化后总是不长斑是怎么回事啊？
有没有做过TOPO克隆的有什么好的经验指导一下啊？

TOPO vector 是invitrogen公司的一个TA克隆的质粒载体系列。http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf
Pfu酶是高保真酶，扩增后不带A的，所以你扩增得到大约500bp的片段如果没有经过加A处理，是不能直接用于TOPO vector做TA克隆的。
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5楼2011-10-11 14:47:04
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xiaoshu8833

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-10-11 07:47:04:
TOPO vector 是invitrogen公司的一个TA克隆的质粒载体系列。http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf
Pfu酶是高保真酶，扩增后不带A的，所以你扩增得到大约500bp的片段如果 ...

这个答案靠谱~~要自己加一步的~~
PS：你扩增的片段纯化回收的方法也可能对后面的连接有影响~~
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Boncourage
6楼2011-10-11 17:41:17
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另一个天堂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 王玉民 at 2011-10-11 10:18:05:
多谢！再请问1.如何确定是否连接上了载体？
2.如何检测扩增片段是否正确，大小用琼脂糖检测的是正确的，末端如何检测呢？
3.连接产物和感受态的比例多少最合适呢？

你请教一下5楼吧，看你用的是pfu酶。我们实验是一般用国产酶做转化
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7楼2011-10-12 10:29:35
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王玉民

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaoshu8833 at 2011-10-11 17:41:17:
这个答案靠谱~~要自己加一步的~~
PS：你扩增的片段纯化回收的方法也可能对后面的连接有影响~~

TOPO载体要求的连接片段是平端的，所以我才用Pfu酶去掉A的。
再请问一下，做转化的时候连接产物和感受态的比例是多少最合适呢？
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心晴
8楼2011-10-12 11:52:35
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xiaoshu8833

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 王玉民 at 2011-10-12 04:52:35:
TOPO载体要求的连接片段是平端的，所以我才用Pfu酶去掉A的。
再请问一下，做转化的时候连接产物和感受态的比例是多少最合适呢？

这样哦~~我也用Pfu酶，不过我不用TOPO载体~~
转化的时候连接产物和感受态的推荐比例是3:1，不过这个不是死的规定，我一般会弄个1:1的一个3:1的，看哪个更好~~
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Boncourage
9楼2011-10-14 18:27:05
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-10-11 14:47:04
TOPO vector 是invitrogen公司的一个TA克隆的质粒载体系列。http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf
Pfu酶是高保真酶，扩增后不带A的，所以你扩增得到大约500bp的片段如果没有经过加A处 ...

这个问题，貌似我做过pfu直接连的。。。没验证出来。。后来加 了rtaq酶。
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
10楼2013-10-27 11:34:11
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