应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：请问做TOPO克隆时总是连接不上怎么回事啊？
101/1返回列表
查看: 2973  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

王玉民

新虫 (小有名气)

[求助] 求助：请问做TOPO克隆时总是连接不上怎么回事啊？

请教高手：
我用Pfu酶扩增得到大约500bp的片段，与TOPO载体连接时，连接转化后总是不长斑是怎么回事啊？
有没有做过TOPO克隆的有什么好的经验指导一下啊？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
心晴
1楼 2011-10-11 09:25:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

另一个天堂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助发帖！ 2011-10-11 21:56:13
1.涂板：玻璃棒温度过高或离酒精灯太近被烧死了：或者涂板时液体没涂干
2.确定目的基因是否连接上了载体
3.检验一下你的扩增片段
4.考虑是不是培养基的问题
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-10-11 09:58:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王玉民

新虫 (小有名气)
多谢！再请问1.如何确定是否连接上了载体？
2.如何检测扩增片段是否正确，大小用琼脂糖检测的是正确的，末端如何检测呢？
3.连接产物和感受态的比例多少最合适呢？
赞一下 回复此楼
心晴
3楼2011-10-11 10:18:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

不会是感受态效率不高所致吧？
赞一下 回复此楼
在等待中涅槃重生
4楼2011-10-11 14:36:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
1楼: Originally posted by 王玉民 at 2011-10-11 09:25:09:
请教高手：
我用Pfu酶扩增得到大约500bp的片段，与TOPO载体连接时，连接转化后总是不长斑是怎么回事啊？
有没有做过TOPO克隆的有什么好的经验指导一下啊？

TOPO vector 是invitrogen公司的一个TA克隆的质粒载体系列。http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf
Pfu酶是高保真酶，扩增后不带A的，所以你扩增得到大约500bp的片段如果没有经过加A处理，是不能直接用于TOPO vector做TA克隆的。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-10-11 14:47:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaoshu8833

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-10-11 07:47:04:
TOPO vector 是invitrogen公司的一个TA克隆的质粒载体系列。http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf
Pfu酶是高保真酶，扩增后不带A的，所以你扩增得到大约500bp的片段如果 ...

这个答案靠谱~~要自己加一步的~~
PS：你扩增的片段纯化回收的方法也可能对后面的连接有影响~~
赞一下 回复此楼
Boncourage
6楼2011-10-11 17:41:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

另一个天堂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 王玉民 at 2011-10-11 10:18:05:
多谢！再请问1.如何确定是否连接上了载体？
2.如何检测扩增片段是否正确，大小用琼脂糖检测的是正确的，末端如何检测呢？
3.连接产物和感受态的比例多少最合适呢？

你请教一下5楼吧，看你用的是pfu酶。我们实验是一般用国产酶做转化
赞一下 回复此楼
7楼2011-10-12 10:29:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王玉民

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaoshu8833 at 2011-10-11 17:41:17:
这个答案靠谱~~要自己加一步的~~
PS：你扩增的片段纯化回收的方法也可能对后面的连接有影响~~

TOPO载体要求的连接片段是平端的，所以我才用Pfu酶去掉A的。
再请问一下，做转化的时候连接产物和感受态的比例是多少最合适呢？
赞一下 回复此楼
心晴
8楼2011-10-12 11:52:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaoshu8833

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 王玉民 at 2011-10-12 04:52:35:
TOPO载体要求的连接片段是平端的，所以我才用Pfu酶去掉A的。
再请问一下，做转化的时候连接产物和感受态的比例是多少最合适呢？

这样哦~~我也用Pfu酶，不过我不用TOPO载体~~
转化的时候连接产物和感受态的推荐比例是3:1，不过这个不是死的规定，我一般会弄个1:1的一个3:1的，看哪个更好~~
赞一下 回复此楼
Boncourage
9楼2011-10-14 18:27:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-10-11 14:47:04
TOPO vector 是invitrogen公司的一个TA克隆的质粒载体系列。http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf
Pfu酶是高保真酶，扩增后不带A的，所以你扩增得到大约500bp的片段如果没有经过加A处 ...

这个问题，貌似我做过pfu直接连的。。。没验证出来。。后来加 了rtaq酶。
赞一下 回复此楼
应助之星就是我~没错。你没有看错~
10楼2013-10-27 11:34:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 王玉民 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +5 Ncdx123456 2026-03-13 6/300 2026-03-15 23:39 by lovewei0727
[考研] 326求调剂 +3 上岸的小葡 2026-03-15 4/200 2026-03-15 18:50 by 无际的草原
[考研] 一志愿985，本科211，0817化学工程与技术319求调剂 +3 Liwangman 2026-03-15 3/150 2026-03-15 18:16 by JourneyLucky
[考研] 26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂 +3 嘉年新程 2026-03-15 3/150 2026-03-15 13:58 by 哈哈哈哈嘿嘿嘿
[考研] 中科大材料专硕319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-13 3/150 2026-03-14 18:10 by houyaoxu
[考研] 297一志愿上交085600求调剂 +5 指尖八千里 2026-03-14 5/250 2026-03-14 17:26 by a不易
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +3 Losir 2026-03-12 3/150 2026-03-14 12:11 by 热情沙漠
[考研] 313分生物学求调剂 +6 Yyt杨1 2026-03-09 8/400 2026-03-14 03:00 by JourneyLucky
[考研] 301求调剂 +3 归零lbm 2026-03-09 3/150 2026-03-14 02:20 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +4 是Lupa啊 2026-03-09 4/200 2026-03-14 02:06 by tranquil_ya
[考研] 考研材料与化工，求调剂 +8 戏精丹丹丹 2026-03-09 8/400 2026-03-14 01:14 by JourneyLucky
[考研] 271求调剂 +10 生如夏花… 2026-03-11 10/500 2026-03-14 00:35 by 卖报员小雨
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 工科调剂 +4 Jiang191123！ 2026-03-11 4/200 2026-03-13 15:15 by Miko19
[考研] 328化工专硕求调剂 +4 。，。，。，。i 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:44 by JourneyLucky
[考研] 268求调剂 +4 好运连绵不绝 2026-03-12 4/200 2026-03-13 10:45 by hyswxzs
[考研] 一志愿华中师范071000，325求调剂 +5 RuitingC 2026-03-12 5/250 2026-03-13 10:43 by hyswxzs
[考研] 0856化工原理 +6 z2839474511 2026-03-10 6/300 2026-03-13 10:41 by houyaoxu
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
[考研] 大连大学化学专业研究生调剂 +3 琪久. 2026-03-10 8/400 2026-03-11 10:02 by 琪久.
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭